李留霞，李秀芳，張?zhí)m蘭，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)生物工程系 鄭州 450001

子癇前期(pre-eclampsia，PE)是指妊娠20周以后出現(xiàn)以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)的一組臨床綜合征，發(fā)病率高達(dá)9.4%～10.4%[1]，嚴(yán)重危害孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒的生命安全，其病因及發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明。有研究[2]證實(shí)多數(shù)PE患者存在有血管內(nèi)皮損傷及血液高凝狀態(tài)。Sheppard等[3]認(rèn)為患者血液中存在某種毒性物質(zhì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凝血異常，但毒性物質(zhì)的性質(zhì)及來源仍不明確。有研究[4-5]報(bào)道PE患者血漿溶血磷脂酸(lysophosphotidic acid，LPA)水平明顯升高，其胎盤組織中LPA受體內(nèi)皮分化基因-4/7(endothelial differentiation gene-4/7，Edg4/7)表達(dá)明顯升高，并與疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)，但LPA是否參與PE患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及損傷機(jī)制至今未見報(bào)道。作者觀察了PE患者血漿對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)增殖能力和Edg4蛋白、mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1血漿的制備收集2011年10月至2012年3月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的PE患者40例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考樂杰主編的全國(guó)統(tǒng)編教材《婦產(chǎn)科學(xué)》(7版)[1]。輕度PE患者20例,年齡(30.5±4.8)歲，孕(36.7±2.5)周;重度20例,年齡(31.4±5.9)歲，孕(34.0±4.2)周；選取同期入院正常晚期孕婦20例，年齡(28.5±2.0)歲,孕(39.0±0.4)周；3組孕婦均無其他產(chǎn)科并發(fā)癥及合并癥。分別于產(chǎn)前采集靜脈血，無菌條件下分離血漿，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2HUVEC的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組HUVEC購(gòu)于湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，使用含體積分?jǐn)?shù)12%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈鋪路石樣緊密排列。待生長(zhǎng)至80%左右融合時(shí)用2.5 g/L胰蛋白酶消化、傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×104mL-1密度接種于96孔板中，每孔200 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后更換無血清RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)37 ℃孵育24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。將細(xì)胞分為對(duì)照組、正常晚孕組、輕度PE組和重度PE組，分別加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液、含體積分?jǐn)?shù)20%正常晚期孕婦血漿、20%輕度PE患者血漿和20%重度PE患者血漿的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行以下各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入20 μL MTT孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，平板搖床振搖20 min，待結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔的D值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR)。IR=(1-實(shí)驗(yàn)孔平均D值/對(duì)照孔平均D值)×100%。

1.4免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Edg4蛋白各組細(xì)胞在24孔板中爬片后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)Edg4蛋白。一抗為兔抗人Edg4蛋白多克隆抗體(按1100稀釋)，購(gòu)于Santa Cruz公司。二抗為山羊抗兔IgG抗體(按1100稀釋)。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)陽性細(xì)胞分布和細(xì)胞染色強(qiáng)度確定Edg4蛋白的表達(dá)水平。首先,高倍鏡下選取5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，0%為0分，<25%為1分，25%～為2分，>50%為3分。再根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分:無染色或染色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深黃色或褐色為3分。取以上兩項(xiàng)的乘積：積分 0～1為陰性(-)表達(dá)；≥2分為陽性(+)表達(dá)。

1.5RT-PCR檢測(cè)Edg4mRNA收集各組細(xì)胞(5～10)×106個(gè)，采用Trizol一步法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)說明書操作合成cDNA。以β-actin作為內(nèi)參基因。根據(jù)GenBank中目的基因cDNA序列,由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成PCR引物。Edg4上游引物序列：5’-GTCGAGCCTGCTTGTCTTC-3’，下游引物序列：5’-CCAGGAGCAGTACCACCTG-3’，產(chǎn)物大小為205 bp；β-actin上游引物序列：5’-CGGGAAATCGT GCGTGAC-3’,下游引物序列：5’-TGGAAGGTGGA CAGCGAGG-3’，產(chǎn)物大小為434 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，用Quantity軟件對(duì)電泳圖像進(jìn)行分析。以目的基因與β-actin條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。4組Edg4蛋白陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，4組IR、Edg4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞的形態(tài)PE組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形或多邊形變?yōu)闄E圓或圓形，細(xì)胞間隙加大，細(xì)胞排列變疏松(圖1)。

2.2 4組細(xì)胞增殖能力測(cè)定結(jié)果PE組IR較正常晚孕組增大，重度PE組IR增大更明顯，見表1。

2.3 4組細(xì)胞Edg4蛋白的檢測(cè)結(jié)果Edg4蛋白主要表達(dá)于HUVEC的胞質(zhì)和胞膜，鏡下可見棕黃色顆粒由淺至深(圖2)。4組Edg4蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,病情越重，Edg4蛋白表達(dá)越強(qiáng)(表1)。

2.4 4組細(xì)胞Edg4mRNA的檢測(cè)結(jié)果見圖3和表1。PE組細(xì)胞Edg4 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組和正常晚孕組，重度PE組高于輕度PE組。

圖1 倒置相差顯微鏡下4組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的形態(tài)(×200)

圖2 4組細(xì)胞中Edg4蛋白的表達(dá)(SP，×400)

組別nIR/%Edg4蛋白/陽性例數(shù)Edg4 mRNA對(duì)照組200.00±0.00 30.176±0.013 正常晚孕組2016.13±5.9380.380±0.018輕度PE組2034.23±5.16?160.787±0.017?重度PE組2047.79±3.30?#190.959±0.003?#F/χ2104.20032.9415 803.360P<0.001<0.001<0.001

*與正常晚孕組比較，P<0.05；#與輕度PE組比較，P<0.05。

圖3 4組細(xì)胞中Edg4 mRNA的表達(dá)

M：Marker；1：對(duì)照組；2：正常晚孕組；3：輕度PE組；4重度PE組。

3 討論

PE是一種“多理論疾病”，其發(fā)病機(jī)制可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凝血纖溶機(jī)制異常、免疫機(jī)制異常等有關(guān)[6-8]，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂是引起該病一系列臨床癥狀的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，也是疾病進(jìn)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在分子水平上，馮亞玲等[9]發(fā)現(xiàn)Rho-GDI在PE蛻膜組織中表達(dá)下調(diào)，通過調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮狀態(tài)，參與PE的發(fā)生發(fā)展。劉大艷等[10]發(fā)現(xiàn)早發(fā)型與晚發(fā)型重度PE的發(fā)病機(jī)制可能不同。研究[11]證實(shí)多數(shù)PE患者存在血管內(nèi)皮損傷及血液高凝狀態(tài)。臨床研究[12]顯示，PE患者胎盤絨毛及血管內(nèi)皮細(xì)胞變性壞死，存在動(dòng)脈粥樣硬化、管腔狹窄及血栓形成伴梗死，從形態(tài)學(xué)上肯定了重度PE患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血栓形成。

該研究分別用PE患者血漿及正常晚孕孕婦血漿干預(yù)HUVEC，通過觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和檢測(cè)細(xì)胞增殖能力以評(píng)估PE患者血漿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。結(jié)果顯示，PE組細(xì)胞間隙加大，細(xì)胞排列變疏松，增殖能力明顯受到抑制，即內(nèi)皮細(xì)胞明顯受到損傷，重度PE組較輕度組損傷更為明顯。據(jù)此推測(cè)，PE患者血漿中可能存在可溶性“毒性因子”，可使內(nèi)皮細(xì)胞受損，且病情越重這種毒性物質(zhì)的濃度越高。

LPA是一種具有細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)作用的多功能磷脂分子，主要由活化的血小板產(chǎn)生[13]，通過G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)[14]。Edg2、4、7是其特異性高親和受體，LPA與其受體結(jié)合后可以激活PI3K/Akt、Ras-MAPK及Rho等多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮促進(jìn)蛋白合成、細(xì)胞骨架重建、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等作用[15-16]。凝血功能改變和血栓前狀態(tài)患者血液中LPA水平也明顯升高，且阿司匹林治療能有效降低其水平并降低血栓的發(fā)生，因此LPA被認(rèn)為是中風(fēng)和血栓前狀態(tài)的敏感預(yù)警因子。當(dāng)血液中LPA水平明顯升高時(shí)，凝血過程開始啟動(dòng)，預(yù)示有血栓形成的可能[17-18]。

作者的前期研究[4-5]表明，整個(gè)妊娠過程中在母體血漿和胎盤組織中分別可檢測(cè)到LPA及其受體Edg4、7蛋白的表達(dá)，但在PE患者血漿及胎盤組織中LPA和Edg4、7蛋白表達(dá)水平顯著升高，并與病情輕重程度正相關(guān)，提示LPA及其受體Edg4、7的過度表達(dá)可能參與了PE的發(fā)生發(fā)展。LPA不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖，也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和線粒體損傷，參與氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等過程[19]。該研究發(fā)現(xiàn)PE患者血漿可誘導(dǎo)HUVEC高表達(dá)Edg4蛋白、mRNA，抑制HUVEC的增殖能力，并且重度PE患者的血漿上述誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。說明PE患者血漿LPA水平升高，Edg4活化，LPA水平升高及Edg4蛋白表達(dá)增高，可以增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)血管平滑肌痙攣，導(dǎo)致血管形態(tài)改變。

總之，血漿LPA水平升高及Edg4活化可能是引起PE患者血管內(nèi)皮損傷的原因之一，但是LPA是否就是血液中的毒性物質(zhì)以及LPA其他受體的作用有待今后進(jìn)一步研究。

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