劉美璇 朱 檸 陳小東

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院呼吸內(nèi)科 上海 200040)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以慢性咳嗽(≥8周)為唯一癥狀且支氣管擴(kuò)張劑治療有效的一類特殊哮喘［1］。CVA的發(fā)病機(jī)制與典型哮喘相似，氣道炎癥與氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness，AHR)是其最典型的病理生理特征［2］。如未經(jīng)規(guī)范治療近30%CVA患者可因出現(xiàn)喘息、胸悶等癥狀發(fā)展為典型哮喘。國內(nèi)外仍將吸入性糖皮質(zhì)激素(inhaled corticosteroids，ICS)作為治療CVA的一線藥物，但目前有關(guān)ICS對CVA氣道高反應(yīng)性的影響，以及ICS治療CVA的療效、最佳療程尚未明確。因此本研究從CVA的發(fā)病機(jī)制出發(fā)，觀察長期吸入激素治療下CVA的氣道反應(yīng)性和炎性介質(zhì)水平的變化趨勢，以評價(jià)ICS的療效和最佳療程，為制定CVA的規(guī)范治療提供理論和臨床依據(jù)。

資料和方法

研究對象 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)CVA入選符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會2009年制定的《咳嗽的診斷與治療指南》的標(biāo)準(zhǔn)［3］，(2)均為我院首次診治的患者，入組前均未應(yīng)用過任何糖皮質(zhì)激素治療。排除標(biāo)準(zhǔn):肺功能參數(shù)FEV1＜70%的受試者，2周內(nèi)的上呼吸道感染者，長期吸煙者，具有嚴(yán)重心肺疾病患者，長期服用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)者及妊娠期婦女。本實(shí)驗(yàn)納入2010年11月至2011年3月在華山醫(yī)院呼吸科門診確診的28例CVA患者［CVA組，男13 例，女15 例，平均年齡(42．96 ±14．23)歲］，選取同期華山醫(yī)院門診體檢部的健康志愿者22例［男12例，女10例，平均年齡(38．76±13．18)歲］作對照組。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會審核，所有參加試驗(yàn)者均簽署知情同意書。

治療和檢測方法 CVA組受試者入組前進(jìn)行基礎(chǔ)肺功能檢測、支氣管激發(fā)試驗(yàn)(bronchial provocation test，BPT)和誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子，入組后開始接受ICS治療，方案為布地奈德粉吸入劑(每次200 μg，每天2次)，必要時(shí)加用萬托林。分別于治療前后 0、3、6、9、12 個(gè)月行 BPT 和誘導(dǎo)痰 IL-5、IL-10水平和嗜酸性粒細(xì)胞檢查，評價(jià)ICS對CVA患者的影響。

肺功能檢測和BPT應(yīng)用Master Screen Body型肺功能儀(德國Jaeger公司)測定，測定方法和指標(biāo)評估根據(jù)ATS標(biāo)準(zhǔn)［4］。BPT使用計(jì)算機(jī)化定量噴射式全自動激發(fā)試驗(yàn)系統(tǒng)(APS氣霧激發(fā)系統(tǒng))霧化吸入法，所選藥物為磷酸組胺(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，5 g/瓶)，首先測定基礎(chǔ)肺功能及吸入生理鹽水2 min后第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)，以最佳 FEV1值作為基礎(chǔ)對照值，然后從 0．03 ～7．8 μmol逐步吸入不同劑量組織胺并監(jiān)測FEV1，當(dāng)FEV1較基線下降≥20%對照值為激發(fā)試驗(yàn)陽性。以FEV1較對照值下降20%的最低累積劑量(PD20-FEV1)為試驗(yàn)的反應(yīng)閾值，反映氣道的敏感性:閾值越低，氣道越敏感，以此評價(jià)氣道高反應(yīng)性程度。

誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子的檢測 用Pin等［5］改進(jìn)的誘導(dǎo)痰方法:霧化前生理鹽水漱口、擤鼻，減少唾液、鼻后滴流對唾液的污染。吸入沙丁胺醇200 μg 10 min后測FEV1作為基礎(chǔ)值。本研究采用高滲鹽水梯度法，先以3．5%高滲鹽水超聲霧化吸入7 min(德國Paryboy公司)，鼓勵患者用力咳痰至無菌培養(yǎng)皿，若無痰或痰量不足則換用4%高滲鹽水繼續(xù)霧化7 min，若仍未收集合格痰標(biāo)本則換用4．5%的鹽水繼續(xù)霧化吸入，7 min終止誘導(dǎo)，直至收集到痰標(biāo)本3～5 mL。每次霧化吸入完畢后都要測FEV1，期間患者出現(xiàn)喘息、氣急、胸悶等癥狀，或FEV1下降≥基礎(chǔ)值20%應(yīng)立即停止操作。操作時(shí)間超過20 min仍未成功誘導(dǎo)的受試者排除。

誘導(dǎo)痰標(biāo)本應(yīng)在2 h內(nèi)處理。挑取痰液中黏稠部分，加4倍體積0．1%的二硫蘇糖醇(DTT)，用巴斯特吸管反復(fù)吹打混勻15次，漩渦器震蕩30 s，于37°C水浴10～20 min，直至痰液標(biāo)本均質(zhì)化，48 μm尼龍網(wǎng)膜過濾，常溫750×g離心沉淀10 min，上清液－80℃凍存待測，細(xì)胞沉渣涂片采用瑞-吉姆薩染色，高倍鏡下計(jì)數(shù)400個(gè)非鱗狀上皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞中嗜酸性粒細(xì)胞的百分比。鱗狀上皮細(xì)胞＜20%為合格痰。

用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)誘導(dǎo)痰上清液的IL-5、IL-10試劑盒(美國PeproTech’s公司)，操作按說明書要求進(jìn)行。靈敏度分別不低于15 pg/mL、10 pg/mL。

結(jié) 果

基本臨床資料 所有研究對象全部完成試驗(yàn)，無中途退出或失訪，整個(gè)研究過程無任何不良反應(yīng)發(fā)生。CVA組血EOS百分比和過敏特性顯著高于健康組(P＜0．05)，兩組間其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

ICS對CVA患者PD20-FEV1的影響 隨ICS治療時(shí)間延長，CVA組PD20-FEV1逐漸增加，其中ICS干預(yù)3個(gè)月后 PD20-FEV1即出現(xiàn)顯著增加(P＜0．05)，由(0．58 ±0．73)μmol上升至(1．19 ±0．69)μmol(P＜0．05)，治療12個(gè)月后CVA組患者氣道高反應(yīng)性趨近于極輕度水平(2．09±0．36)μmol。CVA 組在治療 3、6、9、12 個(gè)月后，分別 3、7、9、14例患者BPT轉(zhuǎn)陰，ICS治療12個(gè)月后，CVA組BPT轉(zhuǎn)陰率為50%。

表1 入選者的基本臨床資料Tab 1 Clinical characteristic of all subjects(±s)

表1 入選者的基本臨床資料Tab 1 Clinical characteristic of all subjects(±s)

(1)vs．Healthy group，P＜0．05．

P0．9200．513 0．224 0．1020．000 0．000

ICS治療前后CVA患者誘導(dǎo)痰IL-5、IL-10及EOS的變化 ICS治療前CVA組誘導(dǎo)痰中IL-5、EOS百分比顯著高于健康對照組(P＜0．05)，IL-10含量顯著低于健康對照組(P＜0．05，表2)。CVA組誘導(dǎo)痰IL-5及EOS水平分別在ICS干預(yù)3個(gè)月、6個(gè)月后較基線水平出現(xiàn)明顯變化(P＜0．05)，但干預(yù)12個(gè)月后CVA組各炎癥觀察指標(biāo)仍顯著高于健康對照組(P＜0．05)。而IL-10在干預(yù)6個(gè)月后出現(xiàn)顯著升高(P＜0．05)，但干預(yù)12個(gè)月后仍顯著低于健康對照組(P＜0．05，表3、4)。

表2 兩組誘導(dǎo)痰IL-5、IL-10和嗜酸性粒細(xì)胞百分比的基線水平Tab 2 The baseline levels of IL-5，IL-10 and EOS in the two groups (±s)

表2 兩組誘導(dǎo)痰IL-5、IL-10和嗜酸性粒細(xì)胞百分比的基線水平Tab 2 The baseline levels of IL-5，IL-10 and EOS in the two groups (±s)

(1)vs．Healthy group，P＜0．05．

Inflammatory mediators CVA group Healthy group P0．0070．0180．031

表3 CVA組治療前后不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)痰IL-5、IL-10含量和EOS百分比Tab 3 The levels of IL-5，IL-10 and EOS in induced-sputum of CVA patients during the ICS treatment(±s)

表3 CVA組治療前后不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)痰IL-5、IL-10含量和EOS百分比Tab 3 The levels of IL-5，IL-10 and EOS in induced-sputum of CVA patients during the ICS treatment(±s)

(1)vs．Before treatment，P＜0．05．

12 months after treatment62．73 ±24．92(1)36．35 ±9．24(1)6．15 ±4．93(1)

表4 治療前后不同時(shí)間點(diǎn)CVA組誘導(dǎo)痰IL-5、IL-10含量和EOS百分比的重復(fù)測量比較統(tǒng)計(jì)值Tab 4 Multiple comparisons of inflammatory mediators between and after ICS treatment by repeated measures

討 論

CVA作為支氣管哮喘(簡稱哮喘)的起始階段，其病理基礎(chǔ)和病理生理特征與哮喘具有高度的相似性。絕大多數(shù)的研究結(jié)論已證實(shí)Th1/Th2失衡即Th2免疫反應(yīng)占優(yōu)勢是哮喘發(fā)病機(jī)制的基石［6］:Th2型細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13等，通過各種機(jī)制參與哮喘的氣道炎癥進(jìn)程。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是近年來提出調(diào)控氣道炎癥的重要細(xì)胞，是關(guān)于哮喘發(fā)病機(jī)制的另一研究熱點(diǎn)，Treg可分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β，對效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用［7］，其中IL-10作為多種細(xì)胞合成分泌的一種“細(xì)胞因子合成抑制因子”，可誘導(dǎo)和維持過敏原免疫耐受，下調(diào)Th2型細(xì)胞因子的合成，抑制肺部促炎因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄。因此，本研究選擇誘導(dǎo)痰中Th2相關(guān)因子IL-5、負(fù)性調(diào)控因子IL-10和免疫效應(yīng)細(xì)胞EOS作為CVA慢性炎癥的量化觀察指標(biāo)，探討CVA患者的氣道炎癥機(jī)制及其在ICS治療過程中的趨勢，以闡明ICS治療CVA的炎癥變化規(guī)律。

目前治療CVA的首選藥物為ICS［8］，ICS進(jìn)入肺部，通過與表達(dá)在靶細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體特異性結(jié)合，影響多種炎性基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗炎癥作用［9］。Shimoda等［10］報(bào)道早期應(yīng)用 ICS 可阻止CVA向典型哮喘發(fā)展。Chaudhuri等［11］發(fā)現(xiàn)吸入氟替卡松14天即可使CVA咳嗽程度減輕，同時(shí)降低誘導(dǎo)痰ECP和呼出氣NO等炎性介質(zhì)的水平。

本研究中用布地奈德粉吸入劑治療CVA患者，治療前CVA組誘導(dǎo)痰中IL-5含量和EOS百分比水平明顯高于健康對照組，CVA患者的IL-10含量低于健康對照組，這與既往的報(bào)道一致［12－14］，提示CVA是以嗜酸性粒細(xì)胞為主的多種炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的氣道慢性炎癥。ICS治療后各種炎性因子皆有不同程度的恢復(fù)，進(jìn)一步證實(shí)ICS能通過抑制IL-5分泌、減少嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及提高IL-10水平來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫環(huán)境，改善氣道炎癥［15］。至隨訪期結(jié)束，CVA的炎癥程度較治療前顯著改善，但仍未達(dá)到健康組水平。這說明CVA炎性介質(zhì)的改善對于早期應(yīng)用ICS反應(yīng)較為敏感，另一方面亦提示CVA氣道炎癥的完全消退仍需要ICS的長期維持。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ICS短期(3個(gè)月)治療CVA可以改善患者的氣道高反應(yīng)性，且治療后各時(shí)間點(diǎn)皆有不同數(shù)量患者BPT轉(zhuǎn)陰。本實(shí)驗(yàn)中觀察到:CVA組在治療 3、6、9、12 個(gè)月后，分別 3、7、9、14 例患者 BPT轉(zhuǎn)陰。盡管ICS的3個(gè)月短期療程可顯著改善CVA患者的氣道炎癥和AHR，但是對于大部分CVA患者來說，仍需更長時(shí)間的ICS治療來完全消除氣道炎癥以使AHR轉(zhuǎn)陰。從本研究的ICS治療12個(gè)月只有50%(14例)的AHR轉(zhuǎn)陰率來看，大多數(shù)CVA患者的ICS療程顯然需要在12個(gè)月以上。

綜上所述，12個(gè)月ICS治療可以顯著降低CVA患者的AHR和氣道炎癥，但AHR的轉(zhuǎn)陰和氣道炎癥的完全消退則需要更長期的ICS維持治療。由于本研究病例數(shù)較少，隨訪期過短，缺乏多中心大樣本的研究，有關(guān)ICS應(yīng)用于CVA的最佳療程仍需要進(jìn)一步的研究。

［1］ Corrao WM，Braman SS，Irwin RS．Chronic cough as the sole presenting manifestation of bronchial asthma［J］．N Engl J Med，1979，300(12):633 －637．

［2］ Niimi A，Matsumoto H，Mishima M．Eosinophilic airway disorders associated with chronic cough［J］．Pulm Pharmacol Ther，2009，22(2):114 －120．

［3］ 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘組學(xué)．咳嗽的診斷與治療指南［J］．中華結(jié)核和呼吸雜志，2009，32(6):407 －413．

［4］ Gardner RM，Hankinson JL．American Thoracic Society:Standardization of spirometry － 1987 update［J］．Am Rev Respir Dis，1988，30(3):272 －273．

［5］ Pin I，Gibson PG，Kolendowicz R，et al．Use of induced sputum cell counts investigate airway inflammation in asthma［J］．Thorax，1992，47(1):25 －29．

［6］ Holgate ST．Pathogenesis of asthma［J］．Clin Exp Allergy，2008，38(6):872 －897．

［7］ Robinson DS．Regulatory T cells and asthma［J］．Clin Exp Allergy，2009，39(9):1314 －1323．

［8］ Dicpinigaitis PV．Chroniccough duetoasthma．ACCP evidence-based clinical practice guidelines［J］．Chest，2006，129(1 suppl):75S －79S．

［9］ Ito K，Chung KF，Adcock IM．Update on glucocorticoid action and resistance［J］．J Allergy Clin Immunol，2006，117(3):522－543．

［10］ Shimoda TT，Kishikawa RR，Shoji SS．Efficacy of airway anti-inflammatory treatments evaluated with airway inflammation markers in patients with cough variant asthma:Budesonide versus montelukast［J］．J Allergy Clin Immunol，2006，117(2):S176．

［11］ Chaudhuri R，McMahon AD，Thomson LJ，et al．Effect of inhaled corticosteroids on symptom severity and sputum mediator levels in chronic persistent cough［J］．J Allergy Clin Immunol，2004，113(6):1063 －1070．

［12］ Niimi R，AmitaniK， SuzukiE， etal．Eosinophilic inflammation in cough variant asthma［J］．Eur Respir J，1998，11(5):1064 －1069．

［13］ Yoo Y，Koh YY，Kang H，et al．Sputum eosinophil counts and eosinophil cationic protein levels in cough-variant asthma and in classic asthma，and their relationships to airway hypersensitivity or maximal airway response to methacholine［J］．Allergy，2004，59(10):1055 －1062．

［14］ De Diego A，Martinez E，Perpina M，et al．Airway in?ammation and cough sensitivity in cough variant asthma［J］．Allergy，2005，60(11):1407 －1411．

［15］ Borish L，Aarons A，Rumbyrt J ，et al．Interleukin-10 regulation in normal subjects and patients with asthma［J］．Allergy Clin Immunol，1996，97(6):1288 －1296．