鄧春閩，鐘天翼，許亞娟，岳曉曉，明津法，左保齊

(現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇蘇州215123;蘇州大學紡織與服裝工程學院，江蘇蘇州215006)

絲素蛋白(SF)是由家蠶絲腺內皮細胞合成、分泌而成的一種天然蛋白質，可從蠶絲中提取，富含甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等20種氨基酸［1］。絲素具有優(yōu)良的物理機械性能［2］、降解性能［3］，用作生物材料時對機體無毒性、致敏性和刺激作用，降解產物不會引起炎癥反應［4］，與人體組織有優(yōu)良的生物相容性，被認為是一種有望在醫(yī)用材料領域開發(fā)利用的天然高分子材料。

在一定條件下，由于親疏水、氫鍵、靜電等多種因素共同作用，再生絲素蛋白(RSF)溶液容易發(fā)生凝膠化，其分子結構由無規(guī)卷曲轉變?yōu)棣?折疊結構［5］。該凝膠柔軟、可塑，對于氣體、低分子物質或某些高分子物質具有選擇透過性，是制備人工皮膚、隱形眼鏡、藥物緩釋載體、酶固定化載體、細胞培養(yǎng)支架等生物醫(yī)用材料的良好載體［6-8］。再生絲素蛋白溶液的凝膠化過程因受絲素濃度、溫度、pH值、金屬離子和剪切作用等因素影響，在人生理條件下凝膠速度較慢，限制了其在生物醫(yī)學領域的應用。

泊洛沙姆(Poloxamer)作為聚氧乙烯-聚氧丙烯醚嵌段共聚物，是一種新型的高分子非離子表面活性劑，其親油基為聚氧丙烯，親水基為聚氧乙烯，相對分子質量分布范圍為1 000～7 000。非離子型表面活性劑在水溶液中不電離，其親水基主要是由具有一定數(shù)量的含氧基團(醚基或羥基)與水構成氫鍵從而實現(xiàn)溶解，正是這一特點決定了非離子型表面活性劑在某些方面比離子型優(yōu)越。而且泊洛沙姆作為一類優(yōu)良的藥物制劑新輔料，無毒，對皮膚粘膜無刺激性、過敏性，對人體十分安全，現(xiàn)已廣泛用于制藥工業(yè)，主要作乳化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和分散劑。組成泊洛沙姆的聚氧乙烯﹣聚氧丙烯的比例及各自相對分子質量的不同，可以使其擁有不同的親油水平衡值，即不同的親疏水性。由于再生絲素蛋白溶液的凝膠化涉及親疏水作用，而泊洛沙姆具有可調的親疏水性，所以選擇泊洛沙姆來調控再生絲素蛋白溶液的凝膠化轉變，可擴大絲素水凝膠在生物醫(yī)用方面的應用。

本研究主要通過泊洛沙姆與再生絲素蛋白溶液共混，加快絲素溶液的凝膠化轉變速度，并對由不同相對分子質量的泊洛沙姆和共混比例形成的RSF-Poloxamer水凝膠的結構和形態(tài)進行了分析，探討了泊洛沙姆的親疏水性對再生絲素蛋白溶液凝膠化的影響。

1 實驗

1.1 實驗材料

無水碳酸鈉(Na2CO3)(化學純，上海興達化學試劑廠);溴化鋰(LiBr·H2O)(化學純，上海恒信化學試劑有限公司);桑蠶絲(浙江湖州);不同相對分子質量的泊洛沙姆:泊洛沙姆P188(相對分子質量1 800，聚氧乙烯80%)，泊洛沙姆P338(相對分子質量3 300，聚氧乙烯80%)，泊洛沙姆P407(相對分子質量4 000，聚氧乙烯70%)(Sigma，美國)。

1.2 RSF-Poloxamer水凝膠

用質量分數(shù)0.5%的碳酸鈉溶液對桑蠶絲脫膠，浴比1︰20，在沸水中煮30 min，然后用去離子水洗滌，如此反復進行3次。

將脫膠的桑蠶絲溶于LiBr︰C2H5OH=40︰60溶液中，恒溫(80±2)℃水浴攪拌溶解獲得再生絲素溶液，經冷卻以后，將絲素溶液注入8 000～14 000的透析袋中，用自來水流動透析1 d，再用去離子水透析2 d，得到純絲素水溶液。最后將絲素水溶液質量分數(shù)調控到3%。

將不同相對分子質量的泊洛沙姆與再生絲素水溶液分別以 3種質量比 1︰3、1︰1、3︰1共混均勻，37℃靜置至形成水凝膠。將制備好的RSF-Poloxamer水凝膠置于冰箱中冷凍1 d。然后再將冷凍樣品放入臺式冷凍干燥機(LGJ，北京四環(huán)科學儀器廠)，－50℃下冷凍干燥3 d后，取出干燥凝膠準備測試。

1.3 主要測試方法

采用美國Nicolet5700型的紅外光譜儀進行測試，波數(shù)范圍為2 000 cm－1～1 000 cm－1，光譜分辨率為4 cm－1，得到凝膠的分子結構;采用荷蘭PANalytical公司的X Pert-Pro MPD全自動X射線衍射儀(CuKα射線，管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描速度2 °/min，衍射角度2θ為5°～45°)測得凝膠的結晶結構;采用美國TA公司熱分析儀(高純氮氣保護，氮氣流量20.0 mL/min，溫度范圍 50.00 ～600.00 ℃，升溫速率10.00℃/min)測定樣品的熱性能變化。采用日本日立公司S4800掃描電鏡觀察凝膠的橫縱截面形態(tài)。

2 結果與討論

2.1 泊洛沙姆對再生絲素溶液凝膠化時間的影響

純絲素溶液在實驗條件下(37℃)要2周以上才能形成水凝膠，從泊洛沙姆對再生絲素溶液凝膠化時間的影響(表1)可以明顯看出，泊洛沙姆與再生絲素共混后極大地加速了再生絲素的凝膠化轉變，并且共混溶液中泊洛沙姆的相對分子質量越小，所占的共混比例越大，其凝膠化時間越短。同時，結果還表明，可以通過調節(jié)泊洛沙姆的相對分子質量和共混比例這兩個因素來控制RSF-Poloxamer水凝膠的凝膠速度，有望在短時間內快速形成水凝膠。

表1 不同相對分子質量和共混比例組成的RSF-Poloxamer溶液的凝膠化時間Tab.1 Gelation time of RSF-Poloxamer solution with different relative molecular masses and blending ratios

泊洛沙姆屬于非離子型表面活性劑，親水親油平衡值(HLB值)表示表面活性劑親水或親油能力的大小。HLB值越大，其親水性越強，HLB值越小，其親油性越強。親水親油轉折點為HLB=10時，小于10時為親油性，大于10為親水性。根據(jù)HLB=7+4.02 log(1/［CMC］)，(CMC 為表面活性劑的臨界膠束濃度)，可以得出泊洛沙姆的HLB值(表2)。

表2 不同泊洛沙姆的HLB值Tab.2 HLB quantitative values of different poloxamers

由表2可見，泊洛沙姆的HLB值均大于10，所以都屬于親水性，且P188親水性最強，這與其相對分子質量較小有關。比較RSF-Poloxamer水凝膠的凝膠化時間規(guī)律可以得出:泊洛沙姆的相對分子質量越小，其親水性越強，促進再生絲素溶液凝膠化的轉變越快。

2.2 分子構象研究(FTIR)

紅外光譜法具有操作簡單、重復性好、精度較高等優(yōu)點，同時又可以對結構進行深入研究，在聚合物材料的應用研究中受到學者的廣泛關注［9］。圖1A、B、C分別為泊洛沙姆P188、P338和P407與再生絲素溶液共混形成RSF-Poloxamer水凝膠后的紅外光譜圖。

圖1 不同相對分子質量和共混比例組成的RSF-Poloxamer水凝膠與純絲素水凝膠的對比紅外光譜圖Fig.1 Comparison of infrared spectrogram of RSF-Poloxamer hydrogel with different relative molecular masses and blending ratios and pure silk fibroin hydrogel

絲素的酰胺I區(qū)(1700～1600 cm－1)散射峰和酰胺Ⅱ區(qū)(1600～1500 cm－1)散射峰指認目前已比較成熟，純絲素水凝膠酰胺I和酰胺Ⅱ的特征峰分別在1625cm－1和1517cm－1，蛋白質二次結構都歸屬于β-折疊構象，可見純絲素水凝膠以β-折疊構象為主。RSF-Poloxamer水凝膠的酰胺I和酰胺Ⅱ的特征峰分別在1625cm－1和1525cm－1左右，其蛋白質二次結構也主要歸屬于β-折疊構象。對比純絲素水凝膠，其酰胺I的特征峰位置幾乎沒有改變，但酰胺Ⅱ的特征峰位置則略往高波數(shù)偏移，說明不同相對分子質量和共混比例的泊洛沙姆對絲素二次結構的改變很小，在RSF-Poloxamer水凝膠中，絲素分子仍然是以β-折疊構象為主。這個結果也表明，泊洛沙姆只是加快了再生絲素溶液凝膠化中的結構轉變過程，并沒有或者很少改變其最終形成水凝膠后的結構。

2.3 結晶結構分析(XRD)

圖2A、B、C分別為泊洛沙姆P188、P338和P407與再生絲素溶液共混形成SF-Poloxamer水凝膠后的XRD譜圖。

一般認為絲素的結晶結構分為:無定形結構、Silk I和SilkⅡ結構。其中Silk I的主要衍射峰為12.2、19.7、24.7°和 28.2°，而 Silk Ⅱ的主要衍射峰為 9.1、18.9、20.7°和 24.0°。

圖2 不同相對分子質量和共混比例組成的RSF-Poloxamer水凝膠與純絲素水凝膠的XRD譜圖Fig.2 XRD spectrograms of RSF-Poloxamer hydrogel with different relative molecular masses and blending ratios and pure silk fibroin hydrogel

如圖2所示，純絲素水凝膠的主要衍射峰在20.7°，屬于SilkⅡ結晶衍射峰;當泊洛沙姆與絲素共混形成RSF-Poloxamer水凝膠后，其共混水凝膠的圖譜則表現(xiàn)為純絲素與泊洛沙姆各自衍射峰的疊加。當泊洛沙姆含量較低時，即與再生絲素溶液1︰3混合時，這種疊加不明顯。但隨著泊洛沙姆含量的增加，這種衍射峰的疊加變得更加明顯，均在 19.1°、23.2°處出現(xiàn)了明顯的特征衍射峰，并且與泊洛沙姆相對分子質量的大小無關，說明這是泊洛沙姆的特征結晶峰。同時，這也表明了RSF-Poloxamer共混水凝膠中存在著絲素與泊洛沙姆兩種結晶結構，兩者只是單純的共混并且相分離。

2.4 熱性能分析(DTA)

圖3A、B、C分別為泊洛沙姆P188、P338和P407與再生絲素溶液共混形成RSF-Poloxamer水凝膠后的DTA譜圖。

圖3 不同相對分子質量和共混比例組成的RSF-Poloxamer水凝膠與純絲素水凝膠的DTA譜圖Fig.3 DTA spectrograms of RSF-Poloxamer hydrogel with different relative molecular masses and blending ratios and pure silk fibroin hydrogel

如圖3所示，純絲素凝膠在292℃有一個明顯的熱分解峰，主要歸因于純絲素水凝膠內大量β-折疊構象的緣故。當泊洛沙姆與再生絲素共混形成RSFPoloxamer水凝膠后，其熱分解峰仍然在292℃左右，基本沒有太大變化，說明了共混水凝膠中絲素還是含有大量的β-折疊構象。這與紅外光譜測試的結果是一致的:泊洛沙姆只是加快了再生絲素溶液凝膠化中的結構轉變過程，并沒有或者很少改變其最終形成水凝膠后的結構。

2.5 形態(tài)結構與分析(SEM)

如圖4所示為絲素溶液分別和泊洛沙姆P188、P338、P407以不同比例共混后形成的SF-Poloxamer水凝膠冷凍干燥后的掃描電鏡圖。A、B、C為P188與再生絲素以 1︰3、1︰1、3︰1 質量比共混;D、E、F 為P388 與再生絲素以3︰1、1︰1、1︰3 質量比共混;G、H、I為 P407 與再生絲素以3︰1、1︰1、1︰3 質量比共混。

圖4 絲素溶液分別和泊洛沙姆P188、P338、P407以不同比例共混后形成的RSF-Poloxamer水凝膠冷凍干燥后的SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM photograph of frozen and dried RSF-Poloxamer hydrogel prepared by silk fibroin solution respectively blending with Paloxamers P188，P338 and P407 in different ratios

從圖4可以看出，雖然含有不同泊洛沙姆及共混比例的RSF-Poloxamer凝膠形態(tài)均有不同的變化，但是其總體都呈現(xiàn)為片層狀結構，一般認為這是由于其凝膠化過程中大量絲素分子由無規(guī)卷曲轉變?yōu)棣?折疊結構所致，這與結構測試的結果是一致的。同時，隨著共混比例中泊洛沙姆的增加，RSF-Poloxamer凝膠的片層結構變得越來越規(guī)整。

3 結論

1)將不同相對分子質量泊洛沙姆與絲素溶液以不同比例混合形成RSF-Poloxamer凝膠，并用FTIR、XRD、DTA、SEM對水凝膠進行了結構表征。結果表明，泊洛沙姆可以明顯加速再生絲素蛋白溶液的凝膠化過程，并且對其形成水凝膠后的結構和形態(tài)影響很小。

2)RSF-Poloxamer凝膠可以通過調節(jié)泊洛沙姆的相對分子質量和共混比例這兩個因素來控制RSFPoloxamer水凝膠的凝膠速度，有望在短時間內快速形成水凝膠，從而擴寬了絲素水凝膠的應用范圍。

［1］AKIRA M.Mechanisms of silk fibroin sol-gel transitions［J］.The Journal of Physcical Chemistry B，2006，110(43):21630-21638.

［2］寧麗，薛淼，黃海寧，等.皮膚再生膜的生物相容性系列研究［J］.中國修復重建外科雜志，2000，14(1):44-48.NING Li，XUE Miao，HUANG Haining，et al.Study on biocompatibility of skin reproductive membrane［J］.Chinese Journal Reparative and Reconstructive Surgery，2000，14(1):44-48.

［3］LI M Z，MASAYO O，NORIHIKO M.Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets［J］.Biomaterials，2003，24(2):357-365.

［4］王洪，嚴力軍，楊述華，等.絲狀支架韌帶材料機械強度和體外降解性研究［J］.中華實驗外科雜志，2006，23(7):881-883.WANG Hong，YAN Lijun，YANG Shuhua，et al.Studies on mechanical strength and degradation in vitro of silk matrix for tissue engineered ligaments［J］.Chinese Journal of Experimental Surgery，2006，23(7):881-883.

［5］朱良均，胡國樑，姚菊明，等.絲素蛋白在膠凝時的分子結構，結晶性的探討［J］.蠶業(yè)科學，1998，24(4):226-229.ZHU Liangjun，HUGuoliang，YAOJuming，et al.Studies on the molecular structure and crystallinity of fibroin protein during gelation［J］.Science of Sericulture，1998，24(4):226-229.

［6］MINOUR N，TSUKADA M，NAGURA M.Physic-chemical properties of silk fibroin membrane as a biomaterial［J］.Biomaterials，1990，11:430-434.

［7］OPDAHL A，KIM S H，KOFFAS T S，et al.Surface mechanical properties of pHEMA contact lenses:viscoelastic and adhesive property changes on exposure to controlled humidity［J］.Journal of Biomedical Materials Research:Part A，2003，67(1):350-356.

［8］NOWAK A P，BREEDVELD V，PAKSTISL，et al.Rapidly recovering hydrogel scaffolds from self-assembling diblock copolypeptide amphiphiles［J］.Nature，2002，417:424-428.

［9］周文，陳新，邵正中.紅外和拉曼光譜用于對絲蛋白構象的研究［J］.化學進展，2006，18(11):1514-1522.ZHOU Wen，CHEN Xin，SHAO Zhengzhong.Conformation studies of silk proteins with infrared and roman spectroscopy［J］.Chemistry Progress，2006，18(11):1514-1522.