秦 智，羅和生，肖國(guó)強(qiáng)

（1.武漢體育學(xué)院 健康科學(xué)學(xué)院，武漢 430079；2.武漢大學(xué) 人民醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430060；3.華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣州 510006）

全球非酒精性脂肪肝?。╪on－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的平均發(fā)病率大約在20%左右［1］。臨床醫(yī)學(xué)上，針對(duì)NAFLD 仍缺乏特效的治療藥物［2］。近年來(lái)，研究表明：低溫具有抗炎、鎮(zhèn)痛及提高機(jī)體免疫力等綜合生物學(xué)效應(yīng)。低溫亦如雙刃劍，長(zhǎng)時(shí)間低溫會(huì)給機(jī)體造成傷害。由此，亞低溫研究隨之誕生與興起。亞低溫狀態(tài)特指：動(dòng)物直腸溫度維持在33℃左右，而常溫動(dòng)物直腸溫度維持在37℃左右，兩者間直腸溫度平均相差3－4℃［3－4］。研究表明，寒冷可以誘導(dǎo)機(jī)體生成熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs），亦稱應(yīng)激蛋白（stress proteins，SP）［5］。本研究采用在SD 大鼠NAFLD 模型建造過(guò)程中，對(duì)其實(shí)施亞低溫狀態(tài)5周游泳運(yùn)動(dòng)聯(lián)合干預(yù)，通過(guò)比對(duì)研究各組別鼠肝組織病理切片、血清脂肪代謝指標(biāo)、鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)和HSP70mRNA 表達(dá)量及其HSP70生成量的變化，旨在探討研究延緩NAFLD 的機(jī)制，為最終實(shí)現(xiàn)人類探尋預(yù)防與改善NAFLD 有效措施研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 NAFLD 動(dòng)物模型的建造

借鑒美國(guó)Charles等［6］研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用高脂液體飼料喂養(yǎng)SD 大鼠（供給能量分別為脂肪71%，碳水化合物11%，蛋白18%），5 周后取材制備肝組織切片HE染色，送檢執(zhí)業(yè)病理醫(yī)師診斷，完成NAFLD 動(dòng)物造模［7］。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3月齡SPF級(jí)雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠，體重200±20g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2008－0002粵監(jiān)證字2008D007。飼養(yǎng)條件：分籠飼養(yǎng)（4－5 只／籠），室溫20±2℃，濕度在55%左右。隨機(jī)分為6組：對(duì)照組（control group，C，n＝10）、高脂組（fat group，F(xiàn)，n＝10）、常溫游泳高脂組（temperature swimming fat，TS，n＝10）、常溫浸泡高脂組（temperature immersion fat，TI，n＝10）、亞低溫游泳高脂組（hypothermia swim fat，HS，n＝10）、亞低溫浸泡高脂組（hypothermia immersion fat，HI，n＝10）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

在4只內(nèi)壁光滑的大水桶內(nèi)進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳，每桶5只大鼠。水桶高為70cm，直徑60cm，水深55cm，每只大鼠的游泳面積均大于500cm2。通過(guò)兌加熱水將常溫水溫度控制在33±1℃，亞低溫狀態(tài)水溫度則通過(guò)添加預(yù)制冰塊控制在28±1 ℃——維持動(dòng)物直腸溫度在33 ℃左右。

TS和HS組大鼠每天進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練15min，在1周內(nèi)逐漸增加至每天60 min無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，每周6 天，維持此運(yùn)動(dòng)量，共5 周。訓(xùn)練過(guò)程中，TS 和HS 組各有1只大鼠溺水死亡，故實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，TS和HS組的樣本量均為9只。

1.4 取材

5周末24h后，宰殺大鼠取材，取材前動(dòng)物禁食12h。所有取材器械均經(jīng)高壓滅菌并高溫（200℃）烘烤6h處理。腹腔注射10%水合氯醛（0.4 ml／100g weight），麻醉成功后，沿腹正中線打開(kāi)腹腔，充分暴露腹主動(dòng)脈采血8－10 ml，置于不抗凝采血管中室溫靜置30 min，4 ℃離心（3 500rpm）15min，取血清，－80 ℃保存，待測(cè)血清生化指標(biāo)。切取肝中葉同一部位1cm×1cm×1cm 組織置于10%甲醛溶液中固定保存24－48h，用于制備組織病理學(xué)切片。另將肝中葉切塊分裝于凍存管，放置于－196℃液氮罐中備用，待測(cè)HSP70和HSP70mRNA。

1.5 肝組織病理切片制作

HE染色，光鏡下觀測(cè)肝組織學(xué)變化。

將組織塊選取同一部位進(jìn)行切塊并修塊、脫水、沖水透明后，浸蠟、包埋、切片、撈片、攤片，在60 ℃干燥箱中過(guò)夜后，進(jìn)行HE染色。

1.6 血清脂肪代謝指標(biāo)測(cè)定

甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）均采用比色法，在全自動(dòng)生化儀上按照試劑盒說(shuō)明測(cè)試；血清FFA 采用比色法，在722分光光度計(jì)上按照試劑盒說(shuō)明測(cè)試。

1.7 鼠肝氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法測(cè)試，其測(cè)試原理：過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm 處有最大吸收峰，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，通過(guò)公式可計(jì)算出組織中MDA 的含量。

超氧化物歧化酶（SOD）采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)試，其測(cè)試原理：通過(guò)黃嚓吟及黃嗓吟氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化輕胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣本中含SOD 時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式可求出被測(cè)樣本中的SOD 活力。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH）采用比色法測(cè)試，其測(cè)試原理：GSH 和二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應(yīng)時(shí)能作用生成5一硫代二硝基苯甲酸陰離子，呈現(xiàn)較穩(wěn)定的黃色，在420nm 處測(cè)定其吸光度即可計(jì)算出GSH 的量。

1.8 肝組織HSP70含量測(cè)定

采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)試，試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作后立即測(cè)定結(jié)果：在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD 值；以吸光度OD 值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的HSP70標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的HSP70含量可根據(jù)其OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

1.9 肝組織HSP70，mRNA Real－Time PCR 相對(duì)定量分析的測(cè)定

在PCR 反應(yīng)體系中添加熒光物質(zhì)，利用熒光物質(zhì)和PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)操作步驟：首先進(jìn)行RNA 抽提，接著進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行Real－Time PCR 進(jìn)行相對(duì)定量分析。HSP70及內(nèi)參基因GAPDH信息見(jiàn)表1。

表1 HSP70及GAPDH 基因信息

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，各均值用多個(gè)Independent－Samples T Test；關(guān)聯(lián)度高的反映同功能的生理指標(biāo)則采用Paired－Samples T Test處理，顯著性水平為P＜0.05，非常顯著性水平為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)變化

肝組織病理學(xué)切片HE染色，亞低溫游泳組相比常溫游泳組SD 大鼠NAFLD 動(dòng)物模型光鏡下：肝小葉結(jié)構(gòu)更清晰，脂滴空泡視野數(shù)目顯著性減少。

圖1 C組HE染色（40×10）

圖2 F組HE染色（40×10）

圖3 HS組HE染色（40×10）

2.2 血清脂肪代謝指標(biāo)的變化

結(jié)果顯示，F(xiàn) 組血清學(xué)脂肪代謝指標(biāo)表現(xiàn)為升高的變化，其中TG、TC、FFA 同C 組比較，均呈非常顯著性差異（P＜0.01）；LDL 同C 組比較，呈顯著性差異（P＜0.05）；HDL同C組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。HS組血清學(xué)脂肪代謝指標(biāo)表現(xiàn)為降低的變化，其中TG、TC、FFA 同F(xiàn)組比較，均呈非常顯著性差異（P＜0.01）；LDL同F(xiàn) 組比較，呈顯著性差異（P＜0.05）；HDL 同F(xiàn) 組比較，無(wú)顯著性差異。TS組血清學(xué)脂肪代謝指標(biāo)表現(xiàn)為降低的變化，其中TG、TC、FFA 同F(xiàn) 組比較，呈顯著性差異（P＜0.05）；LDL、HDL同F(xiàn)組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。HI、TI組血清學(xué)脂肪代謝指標(biāo)：TG、TC、FFA、LDL、HDL同F(xiàn)組比較，表現(xiàn)為降低的變化，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 TS組HE染色（40×10）

圖5 HI組HE染色（40×10）

圖6 TI組HE染色（40×10）

表2 血清學(xué)脂肪代謝指標(biāo)的比較

2.3 肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

結(jié)果顯示，F(xiàn) 組肝組織MDA 同C 組比較，呈升高變化，有非常顯著性差異（P＜0.01）；F 組肝組織GSH、SOD同C組比較，呈降低變化，均有非常顯著性差異（P＜0.01）。HS組肝組織MDA 同F(xiàn)組比較，呈降低變化，有非常顯著性差異（P＜0.01）；HS 組肝組織GSH、SOD 同F(xiàn)組比較，呈升高變化，有非常顯著性差異（P＜0.01）。TS組肝組織MDA 同F(xiàn) 組比較，呈降低變化，有顯著性差異（P＜0.05）；TS組肝組織GSH、SOD 同F(xiàn) 組比較，呈升高變化，有顯著性差異（P＜0.05）。HI、TI組肝組織MDA同F(xiàn)組比較，呈降低變化，但均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；HI、TI組肝組織GSH、SOD 同F(xiàn)組比較，呈升高變化，但均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表3 肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

2.4 肝組織HSP70的變化

結(jié)果顯示，F(xiàn)組的肝組織HSP70同對(duì)照組C 比較呈升高變化，但是無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。HS 組的肝組織HSP70同對(duì)照組C、F組比較呈升高變化，有非常顯著性差異（P＜0.01）。HI組、TS組、TI組肝組織HSP70同對(duì)照組C、F組比較呈升高變化，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表4 肝組織HSP70的比較

2.5 肝組織HSP70mRNA Real－Time PCR相對(duì)定量分析的變化

結(jié)果顯示，F(xiàn) 組的肝組織HSP70 mRNA Real－Time PCR 表達(dá)量同C組比較，呈升高變化，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。HS組的肝組織HSP70mRNA Real－Time PCR 表達(dá)量同對(duì)照組C、F組比較，均呈升高變化，有非常顯著性差異（P＜0.01）。HI組、TS組、TI組的肝組織HSP70mRNA Real－Time PCR表達(dá)量同對(duì)照組C、F 組比較，均呈升高變化，但是均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表5 肝組織HSP70mRNA Real－Time PCR表達(dá)量差異的比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HS組（圖1－3）肝組織病理切片光鏡下：肝小葉結(jié)構(gòu)尚可見(jiàn)。肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，形成肝細(xì)胞索，但是結(jié)構(gòu)有些紊亂。肝細(xì)胞內(nèi)、核周可見(jiàn)少量（＞30%視野）脂肪小空泡，散布于胞漿中，即小泡性脂肪變性。伴有融合性大空泡出現(xiàn)。F 組（圖1－2）肝組織病理切片光鏡下：肝小葉與肝細(xì)胞索消失。肝細(xì)胞內(nèi)、核周可見(jiàn)大量（＞90%視野）脂肪小空泡，散布于胞漿中，即小泡性脂肪變性。伴有融合性大空泡出現(xiàn)，將胞核擠壓至細(xì)胞膜邊側(cè)，酷似脂肪細(xì)胞，并彼此融合成大小不一的脂囊。HS組同F(xiàn)組比較呈肝細(xì)胞脂肪變程度減輕，有非常顯著性差異（P＜0.01）。

不難看出，亞低溫狀態(tài)聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)組相比NAFLD 造模組肝組織病理切片光鏡下：肝小葉結(jié)構(gòu)尚清晰，肝索可見(jiàn)，核周脂肪小空泡數(shù)目明顯減少，未見(jiàn)融合性大空泡和脂囊出現(xiàn)。依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組頒布的非酒精性脂肪肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］判定亞低溫狀態(tài)聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)延緩NAFLD 形成的效果。

1962年Ritossa首先發(fā)現(xiàn)當(dāng)果蠅唾液腺暴露于熱環(huán)境（熱休克）后，其多絲染色體的膨松方式發(fā)生改變，顯示某些基因的轉(zhuǎn)錄被激活［9］；1974年Tissieres等采用聚丙烯酰胺凝膠電泳從遭受熱休克的果蠅唾液腺中分離出一組新的蛋白質(zhì)HSPs［10］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)之進(jìn)行了廣泛、深入研究發(fā)現(xiàn)：雖然早期研究觀察到熱刺激可誘導(dǎo)HSPs的產(chǎn)生，但后續(xù)許多研究表明，除熱環(huán)境外，許多其它的物理、化學(xué)及生物應(yīng)激原（如缺血、缺氧、寒冷、感染、炎癥、、創(chuàng)傷、放射線、重金屬、能量代謝抑制劑、乙醇及氧自由基等）都可誘導(dǎo)HSPs的產(chǎn)生。因此，HSPs又稱為應(yīng)激蛋白（stress proteins，SP）［5］。HSP廣泛存在于從原核生物到哺乳動(dòng)物的整個(gè)生物界，亦存在于高等生物機(jī)體的各種細(xì)胞，表明它是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中保存下來(lái)的具有重要和普遍生物學(xué)意義的蛋白 質(zhì)組［11－13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表2），HS組血清學(xué)脂肪代謝指標(biāo)表現(xiàn)為降低的變化，其中TG、TC、FFA 同F(xiàn) 組比較，均呈非常顯著性差異（P＜0.01）；LDL 同F(xiàn) 組比較，呈顯著性差異（P＜0.05）；HDL 同F(xiàn)組比較，無(wú)顯著性差異。這表明，在SD 大鼠NAFLD 模型建造過(guò)程中，對(duì)其實(shí)施亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施能非常明顯地改善NAFLD 脂肪代謝、降低血清FFA 濃度，延緩NAFLD 的發(fā)生。本研究認(rèn)為，可能是亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施，刺激NAFLD 肝細(xì)胞生成的應(yīng)激蛋白參與了脂質(zhì)代謝，并加速了脂質(zhì)代謝。

HSP對(duì)氧自由基引起細(xì)胞損害的保護(hù)作用的目標(biāo)可能是膜的脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA 或線粒體。HSP70的高表達(dá)可以耐受過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞膜的損傷，減少Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞，從而保護(hù)細(xì)胞免受由活性氧族（Reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的Ca2＋細(xì)胞內(nèi)流所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡。線粒體 可能是HSP保護(hù)的 主要目標(biāo)［14－15］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表3），HS組肝組織MDA 同F(xiàn)組比較，呈降低變化，有非常顯著性差異（P＜0.01）；HS組肝組織GSH、SOD 同F(xiàn)組比較，呈升高變化，有非常顯著性差異（P＜0.01）。這表明，在SD 大鼠NAFLD 模型建造過(guò)程中，對(duì)其實(shí)施亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施，可以非常明顯地增強(qiáng)NAFLD 肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。本研究認(rèn)為，可能是HSP70參與了增強(qiáng)NAFLD 肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力的環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HS組的肝組織HSP70同對(duì)照組C、F組比較呈升高變化（表4），有非常顯著性差異（P＜0.01）。HS組的肝組織HSP70mRNA Real－Time PCR 表達(dá)量同對(duì)照組C、F組比較，均呈升高變化（表5），有非常顯著性差異（P＜0.01）。本研究表明，在SD 大鼠NAFLD 模型建造過(guò)程中，對(duì)其實(shí)施亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施，可以誘導(dǎo)NAFLD 肝細(xì)胞生成大量的應(yīng)激蛋白。本研究認(rèn)為，正是這些誘導(dǎo)生成的大量應(yīng)激蛋白發(fā)揮其綜合生物效應(yīng)，才使得亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施成為更有效延緩NAFLD 發(fā)生、發(fā)展的舉措。

機(jī)體細(xì)胞內(nèi)HSP70家族基因表達(dá)水平增加，可抑制應(yīng)激酶激活及凋亡激活基因的表達(dá)，防止細(xì)胞凋亡［16－18］。HSP70具有分子伴侶生物學(xué)效應(yīng)。分子伴侶是細(xì)胞內(nèi)幫助新合成或解折疊蛋白正確折疊和成功組裝，而自身不具功能的組成蛋白。HSP70作為主要的分子伴侶蛋白，參與到新生、未折疊、錯(cuò)折疊或聚集的蛋白質(zhì)結(jié)合，使某些蛋白質(zhì)解離，減少產(chǎn)生不溶性聚集物的危險(xiǎn)性，并幫助需要折疊的蛋白正確折疊；維持某些肽鏈的伸展?fàn)顟B(tài)，以利于其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等不同區(qū)域內(nèi)發(fā)揮作用；同時(shí)還能促進(jìn)某些變性蛋白的降解和清除，維持酶的動(dòng)力學(xué)特征，以維護(hù) 細(xì)胞功能［19－21］。

HSP70具有抗炎癥反應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。有研究［22－23］發(fā)現(xiàn)：HSP70的表達(dá)能夠抑制肝細(xì)胞中NOS2（Nitric Oxide Synthase2）基因的轉(zhuǎn)錄及合成，降低NOS2的活性，減輕LPS和促炎因子對(duì)組織細(xì)胞的損傷。通過(guò)熱休克和亞砷酸鈉處理誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)HSP增加可抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的IL 8和TNFα在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)IkBa的磷酸化及降解受抑，結(jié)果［24］提示HSP的抗炎作用可能與防止IkBa的激活，進(jìn)而抑制NFkB的活化有關(guān)［25］。

4 小結(jié)

在SD 大鼠NAFLD 模型建造過(guò)程中，實(shí)施亞低溫狀態(tài)下聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施，可以誘導(dǎo)NAFLD 肝細(xì)胞生成大量的應(yīng)激蛋白。HSP70 可能參與并加速脂質(zhì)代謝、參與增強(qiáng)NAFLD 肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力的環(huán)節(jié)、減少線粒體凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的通路和減少炎癥因子的生成，通過(guò)這些途徑延緩NAFLD 的發(fā)生與發(fā)展。

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