陳欣欣，張 舒，石玉鐲

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院生理系，北京100005

2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科，北京100730

磷酸酶和張力蛋白同源物 (phosphatase and tensin homolog，PTEN)是重要的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤中均有較高比例的PTEN缺失或突變，在侵襲性強(qiáng)及預(yù)后較差的腫瘤中尤為多見(jiàn)［1］。PTEN可以拮抗磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)的作用，因而其失活可引起膜受體酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinase，RTK)/PI3K/蛋白酶 B(protein kinase B，PKB or AKT)/雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)通路的活化，從而使細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖失控而導(dǎo)致腫瘤［2］。但是，應(yīng)用mTOR通路抑制劑在臨床上對(duì)腫瘤的治療效果并不十分理想。因?yàn)閙TOR通路抑制劑對(duì)在抑制mTOR的同時(shí)解除mTOR對(duì)RTK/PI3K/AKT的負(fù)反饋抑制作用從而活化了 AKT［3］。此外，有報(bào)道 mTOR抑制劑會(huì)削弱mTOR對(duì)細(xì)胞外調(diào)解蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinase，ERK)/絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路的抑制作用［4］。ERK/MAPK 通路和 RTK/PI3K/AKT/mTOR通路一樣，均是典型的受體酪氨酸激酶調(diào)節(jié)通路，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5-6］。因此，聯(lián)合抑制兩條通路的靶向治療具有較好的前景［4，7-8］。BEZ235 及U0126分別為PI3K/AKT通路及ERK通路的抑制劑，其中BEZ235不同于其他PI3K/AKT通路抑制劑，可以同時(shí)抑制 PI3K及 mTOR兩個(gè)靶點(diǎn)［9］。本研究以PTEN缺失的小鼠胚胎成纖維 (mouse embryonic fibroblast，MEF)細(xì)胞系作為研究模型，探討聯(lián)合使用兩種藥物抑制PTEN基因純合缺失 (PTEN-/-)細(xì)胞增殖的效果。

材料和方法

材料 PTEN純合缺失的小鼠胚胎成纖維母細(xì)胞(PTEN-/-MEF細(xì)胞)由美國(guó)布里格姆婦女醫(yī)院Kwiatkowski教授實(shí)驗(yàn)室經(jīng)由PTEN-/-小鼠的胚胎細(xì)胞中建立，已成系［3，10］?？贵w:ERK(Santa Cruz 公司)、pERK(Cell Signaling公司)、pAKT(Cell Signaling公司)、AKT(Santa Cruz公司)、β-Actin(Santa Cruz公司)、pS6(Cell Signaling公司)、S6(Cell Signaling公司)、二抗 (抗兔)(Santa Cruz公司)。藥品:NVP-BEZ235(Selleck公司)、U0126(Cell Signaling公司)。

藥品配制 NVP-BEZ235:溶解于100%二甲基亞砜中，制備成1 mmol/L的濃度，儲(chǔ)備于－20℃;U0126:溶解于100% 二甲基亞砜中，制備成10 mmol/L的濃度，儲(chǔ)備于－20℃。

MTT法測(cè)定細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 (half maximal inhibitory concentration，IC50)和藥物相互作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PTEN-/-MEF細(xì)胞傳至96孔板，每孔2500個(gè)細(xì)胞。孵育6 h，待細(xì)胞貼壁后，換液，按照不同的藥物濃度加藥。孵育培養(yǎng)48 h，換新鮮的培養(yǎng)基(血清濃度5%)，并加入5 g/L MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后棄上清，加入二甲基亞砜200 μl，搖床上輕輕振蕩10 min，待甲臜沉淀完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490nm處的光密度 (optical density，OD)值。細(xì)胞存活率=樣品組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖曲線 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PTEN-/-MEF細(xì)胞傳至96孔板，每孔2500個(gè)細(xì)胞。孵育6 h，待細(xì)胞貼壁后，換液，加藥。孵育培養(yǎng)一定的時(shí)間 (0、24、48、72 h)后，換新鮮的培養(yǎng)基(血清濃度5%)，并加入5 g/L MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，加入二甲基亞砜200 μl，搖床上輕輕振蕩，待甲臜沉淀完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 490。分別得到4個(gè)時(shí)間點(diǎn) (0、24、48、72 h)的對(duì)照組、BEZ235組、U0126組、BEZ235+U0126組的OD值，以對(duì)照組0 h時(shí)間點(diǎn)的OD值為100點(diǎn)，其他組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值都與之相比得到相應(yīng)的數(shù)值，以此繪制細(xì)胞增殖曲線。

聯(lián)合作用指數(shù) (combination index，CI)值計(jì)算Chou-Talalay公式 (CI等于1表明兩藥之間以相加的方式相互作用，CI小于1表明兩藥之間以協(xié)同的方式相互作用，CI大于1表明兩藥之間以拮抗的方式相互作用)為:CI=CA，X/ICX，A+CB，X/ICX，B(CA，X和CB，X分別是聯(lián)合用藥達(dá)到X%的藥效時(shí)，藥物A和藥物B的濃度;ICX，A和ICX，B分別是單獨(dú)用藥達(dá)到相同的藥效時(shí)，藥物A和藥物B的濃度［11］)。

Western blot檢測(cè)藥物在細(xì)胞中的作用 1×105個(gè)PTEN-/-MEF細(xì)胞接種于6孔板中，6 h細(xì)胞貼壁后，加入一定濃度的BEZ235或 (和)U0126，混勻，孵育24 h后收樣，得到細(xì)胞總蛋白裂解液，經(jīng)SDSPAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗孵育后，曝光、顯影，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩組數(shù)據(jù)間差異用Graphpad Prism軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

BEZ235及 U0126加入 PTEN-/-MEF細(xì)胞后對(duì)RTK/PI3K/AKT/mTOR通路及ERK/MAPK通路活性的效果 首先在PTEN-/-MEF細(xì)胞中對(duì)BEZ235及U0126對(duì)RTK/PI3K/AKT/mTOR及ERK/MAPK通路的抑制作用進(jìn)行驗(yàn)證。AKT及核糖體40S小亞基S6分別位于通路中PI3K及mTOR的下游，其磷酸化形式pAKT、pS6可分別用于標(biāo)識(shí)兩蛋白的活化情況，而pERK則可代表ERK/MAPK通路的活化情況。單獨(dú)加入100 μmol/L U0126時(shí)，pERK的水平顯著下降，pS6水平亦有降低;單獨(dú)加入100 nmol/L BEZ235時(shí)，pAKT及pS6顯著降低，pERK水平也略有降低。聯(lián)合應(yīng)用BEZ235與 U0126，pAKT及 pS6受抑制效果與單用BEZ235基本相同，pERK受抑制水平略強(qiáng)于單獨(dú)使用U0126。Western blot結(jié)果顯示兩藥聯(lián)合與使用單藥效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖1)。

BEZ235及U0126在PTEN-/-MEF細(xì)胞中IC50的測(cè)定結(jié)果 為研究BEZ235和U0126的作用效果，在PTEN-/-MEF細(xì)胞中應(yīng)用MTT的方法，通過(guò)不同劑量的藥物濃度作用，定量BEZ235及U0126的IC50。BEZ235及U0126均可抑制細(xì)胞的增殖，分別在6.257 nmol/L及22.85 μmol/L達(dá)到半數(shù)抑制效果，即在PTEN-/-MEF細(xì)胞中，BEZ235和U0126的IC50分別為6.257 nmol/L 及22.85 μmol/L(圖2)。BEZ235 的濃度在60 nmol/L及以上時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制作用趨于平穩(wěn)。

體外細(xì)胞培養(yǎng)中聯(lián)合應(yīng)用BEZ235和U0126的效果 通過(guò)對(duì)藥物相互作用矩陣實(shí)驗(yàn)的分析顯示，當(dāng)加入不同濃度 (0、10及 100 μmol/L)的 U0126后，BEZ235的IC50曲線逐漸上移 (數(shù)據(jù)處理時(shí)只算入待計(jì)藥物的單獨(dú)藥效)(圖3);從BEZ235曲線上讀取其IC50值，顯示在U0126的干預(yù)下，BEZ235的IC50值逐漸變大。為明確上述結(jié)果，進(jìn)一步估算BEZ235和U0126相互作用的CI值。在不同的藥物濃度下，BEZ235和U0126相互作用的 CI值均大于1。

單獨(dú)使用BEZ235與聯(lián)合應(yīng)用BEZ235和U0126對(duì)抑制細(xì)胞增殖效果的比較 為進(jìn)一步確定聯(lián)合BEZ235和U0126用藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響，設(shè)計(jì)了不同濃度下兩藥聯(lián)合的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用MTT的方法，觀察細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示:加入不同濃度的BEZ 235和/或U0126時(shí)，BEZ235和U0126均抑制PTEN-/-MEF細(xì)胞的增殖，但兩藥物聯(lián)合作用效果不及單獨(dú)使用BEZ235(P＜0.01)(圖4)。

圖1 單獨(dú)和聯(lián)合使用BEZ235、U0126對(duì)膜受體酪氨酸激酶/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白酶B/雷帕霉素靶蛋白通路及細(xì)胞外調(diào)解蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶通路的抑制作用Fig 1 The inhibitory effect of single and combinational usage BEZ235 and U1026 on receptor tyrosine kinase/phosphatidyl inositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin and extracellular regulated protein kinases/mitogen-activated protein kinases pathways

圖2 PTEN缺失的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞生存率隨BEZ235(A)及U0126(B)藥物濃度變化曲線Fig 2 The survival curves of PTEN null mouse embryonic fibroblast cells in response to the BEZ235(A)and U0126(B)treatment

圖3 不同濃度的U0126作用下，PTEN缺失的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞生存率隨BEZ235藥物濃度變化曲線Fig 3 The survival curves of PTEN knock out MEF cells in response to the BEZ235 treatment at the presence of different concentrations of U0126

圖4 PTEN缺失的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在單獨(dú)或聯(lián)合使用BEZ235和U0126處理后的增殖曲線Fig 4 The growth curves of PTEN null MEF cells under the single or combination treatment of BEZ235 and U0126

討 論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟多階段的過(guò)程，其中包括多個(gè)基因位點(diǎn)的突變和多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路的參與。因此針對(duì)某一細(xì)胞信號(hào)通路和腫瘤致病因子的腫瘤治療策略可能被其他的信號(hào)通路的活化和腫瘤位點(diǎn)的突變所抵抗。這些理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果為聯(lián)合抑制RTK/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路及ERK/MAPK信號(hào)通路治療腫瘤提供了依據(jù)。臨床前期的實(shí)驗(yàn)中也已證明聯(lián)合抑制mTOR通路及ERK/MAPK信號(hào)通路在PTEN缺失的前列腺腫瘤和細(xì)胞系中，協(xié)同抑制效果顯著［4］。

為消除mTOR抑制后反饋性的ERK/MAPK信號(hào)通路活化，本研究應(yīng)用ERK激酶促分裂原活化蛋白激酶激酶 (mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)1/2的抑制劑U0126;而為消除mTOR抑制后反饋性的AKT活化，選擇PI3K、mTOR雙重抑制劑BEZ235，希望達(dá)到同時(shí)有效抑制兩條通路的效果，從而更好地抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

通過(guò)Western blot方法本研究檢測(cè)了兩種藥物的抑制效果 (圖1)，結(jié)果表明，單獨(dú)加入U(xiǎn)0126時(shí)，pERK的水平顯著下降，pS6水平亦降低，表明U0126在抑制MEK1/2的同時(shí)抑制了mTOR水平，提示ERK通路可以上調(diào)mTOR。這與文獻(xiàn)［12］中的結(jié)果相吻合。而單獨(dú)加入BEZ235時(shí)，pAKT及pS6顯著降低，表明對(duì)PI3K及mTOR抑制有效。BEZ235同時(shí)抑制了pERK水平，因PI3K在ERK通路上游，抑制PI3K后，ERK通路活性降低，本研究的結(jié)果較好地驗(yàn)證了兩藥的作用效果。但Western blot結(jié)果提示，兩藥聯(lián)合效果并未顯著優(yōu)于使用單藥。

研究表明mTOR抑制劑Rapamycin和MEK抑制劑PD98059以相加方式抑制體外mTOR活化細(xì)胞的增殖［8］。筆者認(rèn)為在PTEN-/-MEF細(xì)胞及PTEN突變的腫瘤中，BEZ235通過(guò)雙重阻斷RTK/PI3K/AKT/mTOR通路，和U0126聯(lián)合作用可能達(dá)到更好的效果，呈協(xié)同方式作用。因此，本研究設(shè)計(jì)了通過(guò)兩藥物在不同的濃度梯度條件下相互作用的矩陣式實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明聯(lián)合應(yīng)用BEZ235和U0126后，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中兩者呈拮抗作用?？紤]可能有以下原因:PTEN-/-MEF細(xì)胞中PTEN基因缺失，可能使得ERK/MAPK通路對(duì)抑制劑作用不敏感。Tang等［13］研究顯示，PTEN缺失的Ishikawa細(xì)胞 (子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系)與重新轉(zhuǎn)染了PTEN基因的Ishikawa細(xì)胞 (PTEN-IK細(xì)胞)相比，表皮生長(zhǎng)因子刺激后細(xì)胞增殖作用不顯著。使用Wortmannin(PI3K抑制劑)或U0126抑制細(xì)胞增殖的效果不及PTEN-IK細(xì)胞。提示在PTEN缺失的情況下，細(xì)胞對(duì)PI3K通路及ERK通路抑制劑敏感性降低。本研究U0126的IC50值為22.85 μmol/L，遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)［14］中報(bào)道的 IC50值，也是 PTEN-/-細(xì)胞對(duì) U0126不敏感的證據(jù)之一。而 BEZ235的IC50值與文獻(xiàn)［15］報(bào)道相符，表明PTEN-/-細(xì)胞對(duì)BEZ235抑制敏感。聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖抑制效果不如單用BEZ235，表明與U0126聯(lián)合使用時(shí)，可能由于通路間復(fù)雜的相互作用，使PTEN-/-細(xì)胞對(duì)BEZ235的敏感性同時(shí)降低。此外，兩藥化學(xué)結(jié)構(gòu)中可能存在產(chǎn)生拮抗作用的位點(diǎn)，使兩藥共同作用時(shí)產(chǎn)生拮抗作用。這種情況下，更換ERK/MAPK抑制劑的種類(lèi)后與BEZ235聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)達(dá)到更好的治療效果。

綜上，本研究在PTEN-/-MEF細(xì)胞系中聯(lián)合應(yīng)用PI3K、mTOR抑制劑BEZ235和ERK/MAPK通路抑制劑U0126時(shí)，兩藥作用方式呈拮抗作用，效果不及單獨(dú)使用BEZ235。因此，筆者建議在 PTEN-/-細(xì)胞系中或PTEN突變的腫瘤中避免聯(lián)合使用BEZ235與U0126，BEZ235單藥即具有較好的抑制細(xì)胞增殖作用，可作為抗腫瘤治療的有效藥物。更換ERK/MAPK抑制劑與BEZ235聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)達(dá)到更好的治療效果。

［1］Vivanco I，Sawyers CL.The phosphatidylinositol 3-kinase AKT pathway in human cancer［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(7):489-501.

［2］Knobbe CB，Lapin V，Suzuki A，et al.The roles of PTEN in development，physiology and tumorigenesis in mouse models:a tissue-by-tissue survey ［J］.Oncogene，2008，27(41):5398-5415.

［3］Zhang H，Bajraszewski N，Wu E，et al.PDGFRs are critical for PI3K/Akt activation and negatively regulated by mTOR［J］.J Clin Invest，2007，117(3):730-738.

［4］Carracedo A，Baselga J，Pandolfi PP.Deconstructing feedback-signaling networks to improve anticancer therapy with mTORC1 inhibitors［J］.Cell Cycle，2008，7(24):3805-3809.

［5］McCubrey JA，Steelman LS，Chappell WH，et al.Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth，malignant transformation and drug resistance ［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773(8):1263-1284.

［6］McCubrey JA，Steelman LS，F(xiàn)ranklin RA，et al.Targeting the RAF/MEK/ERK，PI3K/AKT and p53 pathways in hematopoietic drug resistance ［J］.Adv Enzyme Regul，2007，47:64-103.

［7］Chang JY，Sehgal SN，Bansbach CC.FK506 and rapamycin:novel pharmacological probes of the immune response［J］.Trends Pharmacol Sci，1991，12(6):218-223.

［8］Mi R，Ma J，Zhang D，et al.Efficacy of combined inhibition of mTOR and ERK/MAPK pathways in treating a tuberous sclerosis complex cell model［J］.J Genet Genomics，2009，36(6):355-361.

［9］Maira SM，Stauffer F，Brueggen J，et al.Identification and characterization of NVP-BEZ235，a new orally available dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor with potent in vivo antitumor activity ［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(7):1851-1863.

［10］Ma J，Meng Y，Kwiatkowski DJ，et al.Mammalian target of rapamycin regulates murine and human cell differentiation through STAT3/p63/Jagged/Notch cascade ［J］.J Clin Invest，2010，120(1):103-114.

［11］Zhao L，Wientjes MG，Au JL.Evaluation of combination chemotherapy:integration of nonlinear regression，curve shift，isobologram，and combination index analyses［J］.Clin Cancer Res，2004，10(23):7994-8004.

［12］Ma L，Chen Z，Erdjument-Bromage H，et al.Phosphorylation and functional inactivation of TSC2 by Erk implications for tuberous sclerosis and cancer pathogenesis ［J］.Cell，2005，121(2):179-193.

［13］Tang LL，Yokoyama Y，Wan X，et al.PTEN sensitizes epidermal growth factor-mediated proliferation in endometrial carcinoma cells［J］.Oncol Rep，2006，15(4):855-859.

［14］Davies SP，Reddy H，Caivano M，et al.Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors［J］.Biochem J，2000，351(Pt 1):95-105.

［15］Schnell CR，Stauffer F，Allegrinip R，et al.Effects of the dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor NVP-BEZ235 on the tumor vasculature:implications for clinical imaging ［J］.Cancer Res，2008，68(16):6598-6607.