溫賢濤，賀學(xué)英，李劍，湯菊莉，黃永富

北京市醫(yī)療器械檢驗所，北京市，101111

0 前言

醫(yī)療器械生物學(xué)試驗中樣品制備是生物學(xué)試驗的第一步，是生物學(xué)試驗成功開展的前提，是確保生物學(xué)試驗結(jié)果真實可靠的保證。醫(yī)療器械生物學(xué)評價系列標(biāo)準(zhǔn)GB/T1688-12對樣品制備條件進(jìn)行了推薦，在生物學(xué)試驗中常需要使用樣品浸提液進(jìn)行試驗，即將試驗樣品浸入適宜的介質(zhì)中，在一定的條件下進(jìn)行浸提，然后使用浸提液進(jìn)行一系列的生物學(xué)試驗，其目的在于檢測醫(yī)療器械可溶出物可能導(dǎo)致的生物學(xué)反應(yīng)，以評價產(chǎn)品可能對病人或使用者的潛在危害。系列標(biāo)準(zhǔn)第12部分對浸提法原理進(jìn)行了說明，并對浸提容器、浸提介質(zhì)、浸提條件和方法等均進(jìn)行了推薦，此方法主要參考藥包材的浸提方法[1-4]。但由于醫(yī)療器械的材料、預(yù)期用途、使用方法等與藥包材有很大區(qū)別，加上醫(yī)療器械本身的多樣性，試驗人員應(yīng)該根據(jù)樣品的物理化學(xué)特性等選擇相應(yīng)的浸提條件和方法。目前關(guān)于樣品制備條件的研究國內(nèi)外均開展得不多，可能是由于醫(yī)療器械生物學(xué)評價體系的建立相對較晚，加上醫(yī)療器械的多樣性，醫(yī)療器械材料種類眾多，物理化學(xué)性能相差很大，一一進(jìn)行研究，時間成本和經(jīng)濟(jì)成本均太高。

本文以鎳鈦合金材料作為研究對象，進(jìn)行不同浸提條件下鎳溶出的比較研究。近三十年來，鎳鈦合金以其良好的生物相容性、形狀記憶效應(yīng)和超彈性等特點，已被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域[5]。但是由于鎳鈦合金中鎳含量高，鎳溶出是影響鎳鈦合金生物相容性的一個重要因素[6]。本研究選擇兩家醫(yī)用鎳鈦合金生產(chǎn)廠家提供的鎳鈦合金絲，以生理鹽水作為浸提介質(zhì)，分別在GB/T 16886-12推薦的五種條件下進(jìn)行浸提，采用等離子發(fā)射光譜儀（ICP）分析方法檢測浸提液中鎳濃度，比較不同浸提條件對鎳溶出的影響，選擇最優(yōu)的浸提條件。同時，計算單位質(zhì)量和單位面積下每天鎳離子析出量，根據(jù)GB/T 16886.17推薦的過程[7]，與目前國際已知的鎳毒性限量進(jìn)行比較，評價鎳鈦合金的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

選用直徑為2mm的鎳鈦合金(Ni/ Ti:55/45)，記材料編號為GM和JS，分別由供應(yīng)商A和B提供。

1.2 試劑

生理鹽水、蒸餾水、乙醇、多元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液(100.0 μg/mL)。

1.3 儀器

iCAP6000等離子發(fā)射光譜儀、分析天平、超聲清洗儀、烘箱。

1.4 方法

1.4.1 材料制備

鎳鈦合金絲截成10 mm，用自來水清洗三次，蒸餾水超聲清洗5 min，再用乙醇清洗一次，最后蒸餾清洗三次，37oC烘箱中烘干，干燥器放置24 h以上備用。用10 ml玻璃瓶為容器，稀酸稀堿浸泡后，自來水和蒸餾水分別清洗三次后，37oC烘箱中烘干備用。

1.4.2 浸提

稱取一定量的鎳鈦合金段放入玻璃瓶，按0.2 g/mL的浸提比例加入生理鹽水，在不同浸提條件下進(jìn)行浸提，每個浸提條件設(shè)三個平行樣。浸提結(jié)束后，將鎳鈦合金取出，浸提液備用。

1.4.3 鎳濃度分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用100 μg/mL 多元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成100 μg/L，200 μg/L 及300 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)液，上機繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

濃度分析：進(jìn)樣管直接取浸提原液進(jìn)行分析，結(jié)果取三個平行樣的平均值。

2 結(jié)果與討論

GM與JS鎳鈦合金在不同浸提條件下鎳離子溶出濃度如表1、表2所示。

表1 GM鎳鈦合金在不同浸提條件下鎳溶出情況Tab.1 The dissolution of nickel of GM nitinol under different extraction conditions

據(jù)表1、表2的鎳溶出情況，可以得出以下實驗結(jié)果。(1) 不同浸提條件下所制備浸提液中鎳離子濃度不同。相同溫度條件下，延長浸提時間，浸提液中鎳離子濃度增加。相同浸提時間下，浸提溫度越高，鎳離子濃度增加?？梢婃囯x子的溶出與浸提時間和溫度成正相關(guān)。(121oC,1 h)浸提條件，雖然溫度最高，但由于浸提時間很短，因此析出的離子較少。(50oC,72 h)及70oC,24 h)這兩個浸提條件，溶出離子均明顯高于(37oC,72 h)浸提條件下溶出的離子量，對于GM這種材料(70oC,24 h)溶出離子濃度近(37oC,72 h) 條件下的兩倍。(2) 雖然不同浸提條件下GM和JS兩種材料析出離子濃度的趨勢是一樣的，但同樣浸提條件下析出離子量相差幾百甚至上千倍。(3) 按WHO 1998年報告中數(shù)據(jù)，每人每天從食物獲得的鎳量為(86～406) μg，從水中獲得的鎳量為(5～25) μg[6]。例如用鎳鈦合金材料制備封堵器約0.5 g或冠脈支架約0.1 g，由于總質(zhì)量和表面積小，按此實驗得出的數(shù)據(jù)推算，可判斷這類器械鎳溶出在安全限量以內(nèi)。

表2 JS鎳鈦合金在不同浸提條件下鎳溶出情況Tab.2 The dissolution of nickel of JS nitinol under different extraction conditions

3 結(jié)論

本實驗主要考查了不同浸提條件下鎳鈦合金材料鎳溶出的情況，同時也比較了不同供應(yīng)商提供的鎳鈦合金鎳溶出情況。實驗發(fā)現(xiàn)，16886.12中推薦的五種浸提條件對于鎳鈦合金材料沒有等效性，其中(121oC,1 h)浸提條件下，鎳離子溶出最少，建議今后鎳鈦合金材料的醫(yī)療器械產(chǎn)品生物學(xué)試驗浸提液制備盡量不選擇該浸提條件，以免不能充分浸提材料中的有害物質(zhì)。鎳溶出量受浸提時間和溫度的共同影響，沒有特殊情況時，常規(guī)浸提建議選擇(37oC,72 h)浸提條件，因為該浸提溫度最接近人體實際溫度，更能模擬臨床應(yīng)用時的實際情況，72 h的浸提時間比24 h更為充分。(70oC,24 h)條件下離子濃度最高，此條件可作為加速或加嚴(yán)浸提時選擇的浸提條件，可以縮短浸提時間，并且鎳溶出量最高。此外，如果使用(70oC,24 h)條件制備的浸提液，在進(jìn)行生物學(xué)評價時，可考慮按比例減少浸提液的用量，得到與(37oC,72 h)條件等效的結(jié)果。比如在開展慢（亞慢）性毒性試驗，可減少浸提液的使用量，即減少樣品用量，也盡可能考慮到動物福利的要求，減少每日給藥量，減少動物痛苦。根據(jù)目前能查到的鎳毒理數(shù)據(jù)，結(jié)合該實驗中鎳溶出量檢測結(jié)果，可以基本確定鎳鈦合金材料是生物安全的，如果一種醫(yī)療器械設(shè)計時含有較大質(zhì)量的鎳鈦合金材料，應(yīng)該慎重。本實驗數(shù)據(jù)均是在體外靜態(tài)浸提條件下得到的，相比體內(nèi)的生理環(huán)境較為簡單，因此在對鎳鈦合金醫(yī)療器械進(jìn)行風(fēng)險評估時，應(yīng)充分考慮體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境，如各種無機離子、酶等蛋白質(zhì)以及一些特定的生物力學(xué)環(huán)境等。因此應(yīng)在下一步實驗中開展體內(nèi)試驗，從全身毒性和局部反應(yīng)等方面進(jìn)行研究，特別是考察鎳鈦合金材料長期植入后的鎳的代謝分布及對局部組織的影響。此外，該實驗還發(fā)現(xiàn)即使同樣是鎳鈦合金材料，供應(yīng)商不同，產(chǎn)品的性能差別很大，鎳溶出可以相差幾百甚至上千倍。因此，建議醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)選擇供貨商時，根據(jù)預(yù)期產(chǎn)品性能要求及預(yù)期用途，對供應(yīng)商進(jìn)行充分評價。

[1]ISO 10993-12-2007 Biological evaluation of medical devices-Part 12:Sample preparation and reference materials [S].

[2]ISO 10993-1-2009 Biological evaluation of medical devices-Part 1:Evaluation and testing within a risk management process [S].

[3]GB/T 16886.1-2001 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第1部分:評價與試驗[S].

[4]GB/T 16886.12-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第12部分:樣品制備與參照樣品[S].

[5]鄭玉峰,趙連城.生物醫(yī)用鎳鈦合金[M].北京:科學(xué)出版社,2004.

[6]Mohammed ES,Martha ES,Helge FB.Assessing the biocompatibility of NiTi shape memory alloys used for medical applications[J].Anal Bioanal Chem,2005,381:557-567.

[7]GB/T 16886.17-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第17部分:可瀝濾物允許限量的建立[S].