高靜賢，王莎莎，金夢，嚴小莉

江蘇省醫(yī)療器械檢驗所，南京市，210022

醫(yī)用超聲耦合劑是超聲診斷與治療操作中的專用制劑。為了確保其符合安全、有效的原則，國家食品藥品監(jiān)督管理局早在1998年就制定了耦合劑的行業(yè)標準。隨著耦合劑產品的發(fā)展，相關部門已對相應的標準進行了修訂，新版的YY0299-2008《醫(yī)用超聲耦合劑》標準已于2010年6月1日起實施，標準對產品的生物相容性提出了要求，依據與皮膚短時間接觸的特點，從GB/T16886《醫(yī)療器械生物學評價》標準中選擇試驗方法。標準中要求按照GB/T16886.5-2003中規(guī)定的直接接觸法進行試驗，在短時間（24 h以內）接觸條件下，產品應無細胞毒性[1]。細胞毒性試驗作為評價材料毒性的重要指標，以其簡便、快捷、靈敏性高、重現性好、節(jié)省動物，并且試驗結果有一定的臨床相關性等優(yōu)點被列為首選試驗項目[2]。GB/T16886.5-2003中規(guī)定了3類試驗方法，即浸提液試驗、直接接觸試驗以及間接接觸試驗（包括瓊脂覆蓋法和濾膜擴散法）[3-4]。ISO10993-5:2009標準的附錄C規(guī)定了MTT法檢測細胞毒性的試驗步驟。本試驗選取了無菌型超聲耦合劑，在不同的試驗條件下采用MTT法以及間接接觸法中的瓊脂覆蓋法對其進行細胞毒性評價，以探討醫(yī)用超聲耦合劑細胞毒性的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗細胞選取L929小鼠成纖維細胞株，購自中國科學院上海細胞所。主要藥品與試劑：RPMI1640培養(yǎng)液（GIBCO，USA），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），MTT（AMRESCO，USA），DMSO（AMRESCO，USA）。

1.2 試驗方法

1.2.1 MTT（四唑鹽）比色法

取無菌型與消毒型醫(yī)用超聲耦合劑，按照1 mg/mL、5 mg/mL、25 mg/mL、100 mg/mL及200 mg/mL的比例分別加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，并置于37oC放置24 h制備浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作為陰性對照品；5%的DMSO溶液作為陽性對照。將培養(yǎng)至近匯合的L-929細胞消化，稀釋為1×104U/mL與1×105U/mL，分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL。在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后將每孔中原培養(yǎng)液吸除?？瞻讓φ战M加新鮮培養(yǎng)液200 μL，各組加樣品200 μL：陰性與陽性對照樣品浸提液，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于更換培養(yǎng)液后的24 h將細胞接種密度為105個的培養(yǎng)板取出，置倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。并每孔加入20 μL質量濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內液體，加入200 μL DMSO，置振蕩器上振蕩10 min后，選擇570 nm 在ELX800UV型酶標儀上測定光密度（optical density,OD）值，按以下公式計算相對增殖率(relative growth rate，RGR)：RGR=試驗組吸光度值／對照組吸光度值×100%，并判定細胞毒性級別。

于更換培養(yǎng)液后的72 h將細胞接種密度為104個的培養(yǎng)板取出重復以上MTT試驗。

1.2.2 瓊脂覆蓋法

將培養(yǎng)至近匯合的細胞稀釋成2.5×105U/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，設陰性對照組、陽性對照組及樣品組，每組設3個平行樣，各孔加入2 mL，放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至近匯合狀態(tài)。將溶化的瓊脂培養(yǎng)基與2倍濃縮的含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基等比混合制成混合瓊脂培養(yǎng)基，使瓊脂的最終濃度為2%。棄去上清后每孔加入2 mL混合瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂層凝固后，分別加入2 mL新鮮配制的0.01%中性紅活體染色劑，置于暗處染色20 min后取出，吸除多余的染色劑，分別取無菌型及消毒型醫(yī)用超聲耦合劑均勻涂布于無菌濾紙片上并放置于固化的瓊脂層上，樣品約覆蓋細胞層表面十分之一，陰性對照選用直徑約5 mm、厚約2 mm的高密度聚乙烯圓片，陽性對照選用直徑約5 mm用20%苯酚溶液浸濕的醫(yī)用明膠海綿，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞溶解及褪色的情況，并對細胞毒性的級別進行判定。

1.3 數據處理

數據以平均值±標準誤（Mean±SEM）表示，用計算機統(tǒng)計軟件包Statistica對數據作Students’t檢驗，確定差異顯著性。

2 結果

2.1 MTT（四唑鹽）比色法

表1、表2分別為無菌型醫(yī)用超聲耦合劑在不同的浸提比例情況下，不同接種密度對L-929細胞增殖度的影響與細胞毒性的級別。由表1可以看出，在細胞接種密度為104U/mL時，超聲耦合劑對L-929細胞的增殖率存在影響。在浸提比例為1 mg/mL、5 mg/mL時，細胞毒性反應為1級、2級，而當浸提比例超過5 mg/mL時，耦合劑對細胞的毒性作用極其顯著，達到3、4級。表2顯示，當細胞密度為105U/mL時，浸提比例達200 mg/mL時，無菌型超聲耦合劑才對細胞有顯著的毒性作用，細胞毒性達3級。

表1 醫(yī)用超聲耦合劑的細胞相對增殖率(細胞接種密度:1×104 U/mL)Tab.1 RGR of medical ultrasonic couplant (Inoculum density:1×104 U/mL)

表2 醫(yī)用超聲耦合劑的細胞相對增殖率（細胞接種密度：1×105 U/mL）Tab.2 RGR of medical ultrasonic couplant (Inoculum density:1×105 U/mL)

2.2 瓊脂覆蓋法

表3顯示，用瓊脂覆蓋法檢測無菌型醫(yī)用超聲耦合劑的細胞毒性為1級。

表3 醫(yī)用超聲耦合劑瓊脂覆蓋法結果Tab.3 Results of medical ultrasonic couplant for agar diffusion test

3 討論

臨床操作中，普通(外用)耦合劑需與皮膚、探頭輻射面密切接觸，故除聲學特性外，耦合劑還須滿足不刺激皮膚、不損壞探頭、不臟污衣物的要求。隨著醫(yī)學的發(fā)展，醫(yī)用超聲耦合劑的配方已幾經更新?lián)Q代，現國內正式生產的產品多為卡波姆凝膠型，除了在完好皮膚上使用的通用型制劑外，還有用于腔內和術中的無菌型凝膠制劑，少數企業(yè)已研制生產了消毒型制劑。為了保證臨床使用的安全性，新版的醫(yī)用超聲耦合劑標準按照生物學評價的思路，將老版本上的“衛(wèi)生要求”改為了“生物相容性”，分別對細胞毒性、皮膚致敏和刺激作出了要求?？梢?，醫(yī)療器械生物安全性評價在產品性能指標中占有十分重要的地位。標準中要求用直接接觸法檢測耦合劑的細胞毒性，但是該方法對材料的要求較高，耦合劑產品為凝膠狀無固定形狀，并且具有一定的水溶性，故采用該方法在實際操作中會出現很多問題。

本試驗采用的MTT比色法是浸提液法的一種，用于細胞毒性的定性和定量評價，該法對受試材料溶出物的毒性檢測敏感性較高，也比較符合動物體內的毒性試驗結果[2]。結果顯示，醫(yī)用超聲耦合劑對L-929細胞具有毒性作用，且與其產品類型及添加成份相關，并表現出一定的劑量依賴性。利用MTT法檢測耦合劑的細胞毒性時，同一浸提比例的試驗結果在不同的細胞接種密度及作用時間下顯示出較為明顯的差異。如在浸提比例為1 mg/mL、5 mg/mL及25 mg/mL時，細胞接種密度為1×104U/mL、作用時間為72 h無菌醫(yī)用超聲耦合劑的細胞毒性分別為1、2、3級，而密度為1×105U/mL、作用時間為24 h均未表現出細胞毒性。這些結果提示，細胞毒性檢測結果與浸提液制備方法、細胞接種密度以及浸提液作用時間密切相關。浸提液制備方法直接決定了作用于細胞的毒性物質的多少，而細胞接種密度關系到細胞對一定量的毒性物質的敏感程度。本研究試驗結果顯示，在同一浸提比例下，細胞接種密度大的所反映出的毒性作用小，即高接種密度降低了細胞對毒性的敏感程度。當毒性物質的量一定而細胞接種密度適宜時，作用時間越長，試驗組與空白對照組的正常細胞差距越大，表現出的毒性作用越明顯。

本試驗采用的另一種方法瓊脂覆蓋法是間接接觸法的一種，該方法對材料的要求比直接接觸法低，使用的材料范圍廣，其缺點是受溶出物在瓊脂上擴散程度的影響，當溶出物分子量小，易溶于水，其敏感性就高，反之則低[2]。該方法是一種定性評價方法，在結果判定時褪色區(qū)域的大小及溶解細胞的比例都是通過試驗者的觀察實現的，受到一定的主觀影響。在本試驗中，結果顯示該無菌型耦合劑體外細胞毒性為1級，但不能對其結果作出量化的比較。

由此可見，各類型細胞毒性檢測試驗的原理與方法各不相同，而各方法中又有很多影響檢測結果的參數，根據試驗材料本身的理化性質、毒性作用強弱及其用途正確的選擇試驗方法及相關參數十分重要。孫皎認為，生物學評價試驗的現行標準不完善，生物學評價試驗的方法和評判依據主要參照現行的相關標準文件，而標準推薦的方法并非一定代表當今生物學和醫(yī)學領域中最先進、最有效和最適合的檢測手段[5]。對于醫(yī)用超聲耦合劑產品而言，如何更科學、更準確的評判其細胞毒性的方法尚有待進一步的研究和明確。

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.YY0299-2008 醫(yī)用超聲耦合劑[S].

[2] 賈文英,史弘道.細胞毒性試驗評價醫(yī)用裝置生物相容性的研究概況[J].實用美容整形外科雜志,2001,12(5):253-255.

[3] 由少華.解讀GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學評價》系列標準[J].中國醫(yī)療器械信息,2005,11(1):15-19.

[4] 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T16886.5-2003 醫(yī)療器械生物學評價第5部分體外細胞毒性試驗[S].

[5] 孫皎.醫(yī)療器械的生物學評價與風險探討[J].中國醫(yī)療器械雜志,2006,30(5):386-387.