鄭 培，安沂華，王曉東，滑蓉蓉，朱 巖，母義明

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病足和其他危重病變的重要危險(xiǎn)因素［1］。其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，尚無(wú)確切、有效的治療手段。筆者旨在通過(guò)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)移植治療，觀察其在移植后1、3、6個(gè)月時(shí)血糖控制情況、臨床癥狀改善程度及神經(jīng)電生理各指標(biāo)的變化，并探討HUC-MSCs 移植治療DPN 的可能機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2010-11至2011-07 在武警總醫(yī)院細(xì)胞移植科住院的DPN 患者32例，其中男22例，女10例;年齡36～66歲，平均(51.13 ±10.37)歲;糖尿病病程2～22年，平均(8.75 ±6.45)年?；颊呔橥獠⒑炇鹬橥鈺?。DPN 診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)有明確的糖尿病史;(2)有四肢末端感覺(jué)異常和(或)感覺(jué)障礙，膝、跟腱反射減弱或消失;(3)神經(jīng)電生理檢查異常。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)血糖控制差;(2)目前使用其他藥物治療周圍神經(jīng)病變且所使用的藥物有可能影響干細(xì)胞療效者;(3)有嚴(yán)重下肢潰瘍或壞疽，不適合行下肢介入手術(shù)者;(4)惡性腫瘤;(5)嚴(yán)重的心肝腎疾病;(6)患有可導(dǎo)致周圍神經(jīng)病變的其他疾病;(7)同時(shí)患血液病、感染未完全控制者。

1.2 治療方法

1.2.1 HUC-MSCs 制備及檢測(cè) 采自健康正常孕周的剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的臍帶約10 cm，無(wú)菌條件下分離、培養(yǎng)、傳代。收集第6～8 代的細(xì)胞，利用倒置相差顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定再用于移植。檢測(cè)項(xiàng)目包括:(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué);(2)細(xì)胞表面標(biāo)記;(3)無(wú)菌;(4)支原體;(5)內(nèi)毒素。

1.2.2 干細(xì)胞移植方法 完善術(shù)前檢查后，分別行1次靜脈輸注干細(xì)胞移植和1次右側(cè)股動(dòng)脈穿刺胰腺血管插管輸注干細(xì)胞移植，兩次間隔3～5 d。

1.2.3 觀察指標(biāo) 分別于移植前，移植后1、3、6個(gè)月時(shí)測(cè)定并比較患者的用藥情況，空腹血糖、餐后2 h 血糖、糖化血紅蛋白水平，多倫多臨床評(píng)分系統(tǒng)(TCSS 評(píng)分)［2］、神經(jīng)電生理指標(biāo)，同時(shí)觀察治療過(guò)程中的不良反應(yīng)。神經(jīng)電生理檢查設(shè)備選擇俄羅斯生產(chǎn)的Neurosoft Neuron-Spectrum-5(序列號(hào)150032)。神經(jīng)傳導(dǎo)測(cè)定神經(jīng)包括正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛后神經(jīng)和腓總神經(jīng)，測(cè)定電生理參數(shù)包括感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、感覺(jué)神經(jīng)動(dòng)作電位的波幅、運(yùn)動(dòng)末梢潛伏期、復(fù)合肌肉動(dòng)作電位波幅，檢測(cè)方法見(jiàn)表1。

表1 電生理指標(biāo)檢測(cè)信息

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用±s 表示，術(shù)前、術(shù)后1、3、6個(gè)月各重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析;計(jì)數(shù)資料使用百分率表示，各時(shí)間點(diǎn)百分率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

入組32例均順利完成隨訪。

2.1 血糖控制情況 移植后，有6例(18.75%)完全停用降糖藥物，僅通過(guò)注意飲食和運(yùn)動(dòng)來(lái)調(diào)整血糖;有24例(75.00%)胰島素或口服降糖藥物劑量較移植前下降;有2例(6.25%)胰島素或口服降糖藥物劑量與移植前比較無(wú)變化。移植后1、3、6個(gè)月時(shí)患者的空腹血糖、餐后2 h 血糖、糖化血紅蛋白水平均較移植前下降(P 均＜0.05，表2)，其共同的變化趨勢(shì)為術(shù)后第1個(gè)月下降最明顯，術(shù)后3個(gè)月時(shí)繼續(xù)下降，但幅度較第1個(gè)月時(shí)平坦，第6個(gè)月時(shí)較第1、第3個(gè)月時(shí)略升高，但仍低于術(shù)前值。

表2 糖尿病周圍神經(jīng)病變患者移植前后空腹血糖、餐后2 h 血糖和糖化血紅蛋白水平比較(n=32;)

表2 糖尿病周圍神經(jīng)病變患者移植前后空腹血糖、餐后2 h 血糖和糖化血紅蛋白水平比較(n=32;)

注:與移植前比較，①P＜0.05

2.2 TCSS 評(píng)分 移植前TCSS 評(píng)分為(6.81 ±4.37)分，移植后1、3、6個(gè)月時(shí)分別是(4.25 ±3.22)分、(3.50 ±2.54)分和(3.50 ±2.91)分，移植后各時(shí)間點(diǎn)較移植前TCSS 評(píng)分均降低(P＜0.01)，說(shuō)明移植后患者臨床癥狀得到顯著改善。

2.3 神經(jīng)電生理變化 患者術(shù)前正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛后神經(jīng)和腓總神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)引出率分別為100%、100%、18.75%(6/32)和0%(0/32);治療后，脛后神經(jīng)和腓總神經(jīng)感覺(jué)傳導(dǎo)引出率分別升至37.50%(12/32)和25.00%(8/32)，與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。不同時(shí)間點(diǎn)正中神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)末梢潛伏期、尺神經(jīng)的感覺(jué)傳導(dǎo)速度和運(yùn)動(dòng)末梢潛伏期改善均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 均＜0.05，表3)，變化趨勢(shì)為術(shù)后第1個(gè)月改善最明顯，6個(gè)月內(nèi)均有持續(xù)療效。

2.4 不良反應(yīng) 有4例(12.8%)于介入術(shù)后第2天發(fā)現(xiàn)術(shù)區(qū)有皮下滲血，直徑6～10 cm，囑患者適當(dāng)減少下肢運(yùn)動(dòng)，5～7 d 自行消退，考慮與介入術(shù)后過(guò)早活動(dòng)有關(guān);有2例(6.25%)于臍帶干細(xì)胞移植術(shù)后24 h 內(nèi)有一過(guò)性中、低熱(＜38.0℃)，給予物理降溫后可降至正常。患者住院期間及隨訪過(guò)程中均進(jìn)行體溫、心率、呼吸、血壓等一般狀況檢查及血生化檢查，均未見(jiàn)異常。

表3 糖尿病周圍神經(jīng)病變患者移植前后神經(jīng)電生理指標(biāo)變化情況 (n=32;)

表3 糖尿病周圍神經(jīng)病變患者移植前后神經(jīng)電生理指標(biāo)變化情況 (n=32;)

注:與移植前比較，①P＜0.05

3 討 論

DPN 是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高，危害性大，是導(dǎo)致糖尿病患者喪失勞動(dòng)能力的主要原因之一。DPN 發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，目前普遍認(rèn)為DPN 發(fā)生與以下因素共同作用有關(guān):(1)代謝紊亂，高血糖環(huán)境下線粒體內(nèi)電子傳遞鏈過(guò)氧化物產(chǎn)生過(guò)量，從而導(dǎo)致多元醇通路的激活、糖基化終末產(chǎn)物的形成、蛋白激酶C 通路和氨基己糖通路的激活［3，4］;(2)微血管病變，糖尿病影響小血管內(nèi)皮細(xì)胞，使基底膜變性與玻璃樣變，血流減慢，導(dǎo)致小血管閉塞、神經(jīng)缺血、缺氧;(3)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)減少;(4)過(guò)氧化物和自由基損傷以及必需脂肪酸代謝異常等其他因素［5］。臨床上對(duì)DPN 尚無(wú)特異性治療方法，本研究旨在應(yīng)用HUC-MSCs 移植，觀察能否改善周圍神經(jīng)病變的癥狀和神經(jīng)傳導(dǎo)速度，探索治療DPN 的新方法。

本研究結(jié)果顯示，治療后患者正中神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)末梢潛伏期、尺神經(jīng)的感覺(jué)傳導(dǎo)速度和運(yùn)動(dòng)末梢潛伏期，脛后神經(jīng)感覺(jué)傳導(dǎo)引出率、腓總神經(jīng)的感覺(jué)傳導(dǎo)引出率和運(yùn)動(dòng)末梢潛伏期較治療前均有所改善，證明HUC-MSCs 移植可以改善DPN 各周圍神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)。在神經(jīng)電生理中，神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低主要由神經(jīng)節(jié)段脫髓鞘引起，而動(dòng)作電位波幅下降主要由神經(jīng)節(jié)段軸索變性引起，兩者可相互獨(dú)立［6］。在本研究中，所測(cè)各神經(jīng)的波幅變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能因HUC-MSCs 主要通過(guò)改善周圍神經(jīng)的髓鞘脫失發(fā)揮作用，對(duì)軸索變性的影響不大，從而造成波幅變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但這仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究還顯示，治療后空腹血糖、餐后2 h 血糖、糖化血紅蛋白、TCSS 評(píng)分均較治療前好轉(zhuǎn)，說(shuō)明患者臨床癥狀及血糖情況同樣得到明顯改善。通過(guò)對(duì)移植后1、3、6個(gè)月進(jìn)行隨訪，各觀察指標(biāo)的總體變化趨勢(shì)為術(shù)后第1個(gè)月改善最明顯，術(shù)后6個(gè)月內(nèi)均有持續(xù)療效。本研究中，所采用的移植方式不同于以往報(bào)道的按固定間距下肢肌肉注射的干細(xì)胞移植方法［7］，主要考慮到多點(diǎn)肌肉注射痛苦大，感染概率高，且術(shù)后造成患肢脹痛、水腫加重的可能性大。采用靜脈輸注干細(xì)胞創(chuàng)傷小、不良反應(yīng)小，干細(xì)胞可以到達(dá)四肢最遠(yuǎn)端，而右側(cè)股動(dòng)脈穿刺胰腺血管插管干細(xì)胞移植則是通過(guò)臨床上已經(jīng)相當(dāng)成熟的介入技術(shù)，直接將干細(xì)胞輸送到胰腺血管，修復(fù)胰島功能。

近年來(lái)，大量臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)將自體骨髓或外周血干細(xì)胞移植入缺血肢體后，在缺血、缺氧環(huán)境下可誘導(dǎo)生成血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等，形成新生毛細(xì)血管、再生表皮，并逐漸分化并形成新的毛細(xì)血管，促進(jìn)血管再生［8］;同時(shí)干細(xì)胞可反應(yīng)性分泌多種生長(zhǎng)因子［9，10］，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子等，這些因子能產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用和促進(jìn)局部微血管再生，支持新生血管形成、神經(jīng)再生和重構(gòu)，從而起到治療神經(jīng)損傷的作用，最終可改善和恢復(fù)患肢血流，提高患肢皮膚溫度，緩解下肢疼痛及冷、涼感覺(jué)，使?jié)兠婵s小或愈合［11，12］，提示干細(xì)胞移植可能從整合再生、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、改善神經(jīng)微循環(huán)等途徑治療DPN。但骨髓動(dòng)員和采集為有創(chuàng)操作，對(duì)采集環(huán)境、身體條件、心理接受程度要求較高，且糖尿病下肢缺血患者多為年齡偏大的老年患者，不論是其自體骨髓還是外周血來(lái)源的干細(xì)胞，其數(shù)量、增殖、分化、黏附和成血管能力均降低［13］，可能會(huì)影響治療效果。與骨髓和自體外周血干細(xì)胞相比，臍帶中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞及造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞更原始，分化擴(kuò)增能力更強(qiáng)，誘導(dǎo)分化后獲得足量干細(xì)胞且向血管、骨、肌肉、神經(jīng)分化能力更強(qiáng)大，具有更加有效的干細(xì)胞潛能，且HUC-MSCs 采集簡(jiǎn)單、資源豐富，不存在倫理爭(zhēng)議，故HUC-MSCs無(wú)論是從來(lái)源上還是從生物學(xué)特性及臨床效果上均優(yōu)于骨髓及外周血干細(xì)胞［14］。

本研究尚有以下局限性:樣本量小，未設(shè)對(duì)照組進(jìn)行比較，沒(méi)能從組織學(xué)方面進(jìn)一步研究，長(zhǎng)期療效仍需進(jìn)一步隨訪、觀察。總之，本研究結(jié)果表明，應(yīng)用HUC-MSCs 移植治療糖尿病周圍神經(jīng)病變安全、有效、可行，是臨床治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的一條新思路。

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