周歷萍，肖雯霏，裘劼人，王淑珍

(浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024)

植物基因組研究的基礎，通常要求所提取的DNA 分子應具有較高的純度，且無斷裂、降解現(xiàn)象，以保證下游工作的順利進行。酚類化合物和多糖是影響植物DNA 提取的兩個重要因素，其含量會隨著植物組織的成熟而增加;由于草莓葉片中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、多酚和色素等物質(zhì)，這在很大程度上影響了高質(zhì)量DNA 的提取。為此，本試驗在原有CTAB 法基礎上，對其提取方法進行了改良，旨在獲得高質(zhì)量草莓基因組DNA。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為杭州市農(nóng)科院生物技術所保存的紅頰和章姬組培苗，以及紅頰和甜查理大田苗。

1.2 試劑的配置

DNA 提取緩沖液 (CTAB):0.1 mol·L-1(pH值8.0)的Tris-HC1，1.4 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA，2% CTAB，2% β-巰 基 乙 醇;3 mol·L-1NaAc。

1.3 DNA 的提取方法

稱取草莓葉片0.5 g，放入研缽中，加入液氮研成粉末，移入1.5 mL 的離心管中，向離心管中加入600 μL 預熱的CTAB 提取緩沖液，充分混勻;65℃水浴30～40 min，期間顛倒混勻2～3 次;水浴后加入等體積氯仿∶異戊醇 (24 ∶1)顛倒混勻，水平搖床上搖20～30 min，11 000 r·min-1離心10 min;轉(zhuǎn)移上清液于干凈的1.5 mL 離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，水平搖床上搖20～30 min，11 000 r·min-1離心10 min;轉(zhuǎn)移上清液于干凈的1.5 mL 離心管中，加入2 倍體積的無水乙醇，-20℃放置1 h;11 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入350 μL TE 溶解沉淀，然后再11 000 r·min-1離心10 min，將上清液300 μL 轉(zhuǎn)入1.5 mL 的離心管中，加入1/10 體積的NaAc 和2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻，-20℃放置1 h，11 000 r·min-1離心10 min，棄上清，以70%乙醇洗沉淀2 次，室溫干燥。將干燥DNA 溶于50 μL TE 中，加入1 μL RaseAe，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA 的檢測

取DNA 樣品，并加入溴酚藍，以0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳，置于BIO-RAD Gel Doc 凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照，檢測DNA 的完整性。同時用Bio Spec-nano 濃度儀檢測DNA 的濃度和D 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

由圖1 可以看出，所提取的DNA 電泳條帶明亮整齊，基本無拖尾，表明所提取的DNA 純度較高，且受損程度低，無明顯降解。

2.2 Bio Spec-nano 檢測結(jié)果

從圖2 可知，CATA 法提取的DNA 的D260/D280為1.79～1.96，說明多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除較干凈，DNA 純度較高，達468～1 297 ng·μL-1，可滿足下游工作的需要。

圖1 提取不同草莓品種苗DNA 電泳結(jié)果

圖2 不同草莓材料DNA BioSpec-nano 檢測結(jié)果

由圖3，4 可見，相同方法提取一個品種大田苗和組培苗的DNA 含量存在明顯差異。組培苗的DNA 含量可達1 192.41 ng·μL-1，比大田苗DNA含量高60.1%。表明草莓DNA 的提取中宜選取幼嫩葉片，且以組培苗為佳;同時提取的DNA D260/D280均為1.96，說明提取方法能較好地去除多酚、多糖類物質(zhì)，同時具有較好的穩(wěn)定性。

圖3 紅頰大田總DNA BioSpec-nano 檢測結(jié)果

圖4 紅頰組培苗DNA BioSpec-nano 檢測結(jié)果

3 小結(jié)和討論

材料的選擇及處理。研究表明，利用同種方法對相同植物不同組織的DNA 提取效果往往差異很大，這是由于隨植物個體發(fā)育差異，植物組織中酚類、多糖等代謝物質(zhì)也隨著組織器官的成熟而增加。所以選用幼嫩的葉片是植物提取DNA 的理想材料。草莓組織中富含多酚和多糖類物質(zhì)，因此在草莓的提取中也宜選取幼嫩葉片，以組培苗為佳，盡可能減少多酚和多糖對DNA 提取的影響。

材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA 量少，純度低。此外，β-巰基乙醇的用量也不宜過多，以免清除不凈而影響后續(xù)的試驗。

因CTAB 提取緩沖液低于15℃時易沉淀析出，所以應預先加熱，使其在加入液氮冷凍研磨的材料時，提取緩沖液的濃度不變。

多酚、多糖等代謝物質(zhì)的去除。常規(guī)提取法提取時材料易褐化，DNA 沉淀因含雜質(zhì)呈現(xiàn)棕褐色，且有粘性物質(zhì)附著，這種純度不高的DNA 可能是由于材料在研磨過程中受氧化所致。本試驗在葉片研磨后立即加入2% 巰基乙醇和CTAB 提取緩沖液，有效防止了葉片氧化的發(fā)生，使多糖和核酸有效地分離。同時，采取二次沉淀的方法，進一步去除褐化、粘性附著物，達到了純化DNA 效果。

［1］魏春江，李毅.現(xiàn)代分子生物學實驗技術［M］.北京:高等教育出版社，2006.

［2］鐘衛(wèi)鴻.基因工程技術實驗指導［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2007.

［3］李靜，李榮欽，王超，等.光核桃葉片DNA 提取條件的優(yōu)化［J］.經(jīng)濟林研究，2012，30 (9):80-83.

［4］周春陽，謝立波，李景富，等.辣椒葉片基因組DNA 提取方法的研究［J］.辣椒雜志，2011 (3):35-37.

［5］袁云香，王志平.獼猴桃基因組DNA 提取方法的研究進展［J］.北方園藝，2011 (8):195-197.