張連華，王 嵐，陳洪章*

(1.中國科學院過程工程研究所，生物工程國家重點實驗室，北京 100190;2.中國科學院大學，北京 100049)

化石能源日益短缺，生物質(zhì)能源是一種很有前景的替代能源［1-2］。生物質(zhì)通過生物轉(zhuǎn)化生成的生物燃料中，丁醇被認為是具有廣泛應用前景的新一代生物燃料［3］。丙酮丁醇梭菌具有同時利用木質(zhì)纖維素酶解產(chǎn)生五、六碳糖及寡糖的優(yōu)勢［4-5］。丙酮丁醇發(fā)酵(簡稱丁醇發(fā)酵)成為工業(yè)界與學術(shù)界共同關(guān)注的熱點問題。木質(zhì)纖維素在預處理過程中會產(chǎn)生一定量的副產(chǎn)物，其中包括酚酸、糠醛、稀酸等［6］，這些副產(chǎn)物具有一定的毒性，嚴重降低了發(fā)酵效率，甚至可以完全抑制發(fā)酵的進行，其中毒性最大的為酚類化合物，主要來源于木質(zhì)素的降解［7］，它們能滲透到細胞膜內(nèi)，破壞細胞的完整性和活性，影響發(fā)酵的正常進行［8］。為了正常發(fā)酵，首先要進行脫毒處理或選育抗性發(fā)酵菌株，使丙酮丁醇發(fā)酵成本增加［9-10］，因此以對丙酮丁醇梭菌抑制最大的酚酸物質(zhì)作為考察對象，系統(tǒng)研究其對丙酮丁醇梭菌生長代謝的影響，以期在此基礎上建立不需要脫毒處理的發(fā)酵工藝，同時研究酚酸毒性與其物性的關(guān)系，為預測其他酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌毒性大小建立理論依據(jù)。

木質(zhì)素降解產(chǎn)生的酚酸類物質(zhì)分為3種結(jié)構(gòu)類型:愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)(G型)、紫丁香基結(jié)構(gòu)(S型)和對羥苯基結(jié)構(gòu)(H型)。為了研究木質(zhì)素中酚酸類物質(zhì)對于丙酮丁醇發(fā)酵影響的普遍規(guī)律，作者選取了3種類型中具有代表性的4種酚酸物質(zhì)作為研究對象:阿魏酸(G型)、香草酸(G型)、丁香酸(S型)和對羥基苯甲酸(H型)［11］。丁醇是丙酮丁醇發(fā)酵中最主要的產(chǎn)品，因此本文只考察了丁醇產(chǎn)量的變化。

1 實驗

1.1 菌種及發(fā)酵方法

丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum ATCC824，購自中科院微生物菌種保藏中心。保存培養(yǎng)基為:5% 玉米粉，置于4℃ 冰箱保存。發(fā)酵培養(yǎng)基為:60 g/L葡萄糖，3.68 g/L硫酸銨，1.768 g/L磷酸二氫鉀，2.938 g/L磷酸氫二鉀，10 mg/L對氨基苯甲酸，10 mg/L生物素，0.2% 氫氧化鈣，無機鹽營養(yǎng)液1 mL(1 L 無機鹽溶液含:NaMoO4·2H2O，2.4 g;CoCl2·6H2O，0.24 g;CaCl2·2H2O，1.5 g;FeCl3·6H2O，27 g;H2SO4，28 mL;CuSO4·5H2O，0.25 g;ZnSO4·7H2O，0.29 g;MnSO4·H2O，1.7 g;MgSO4，12 g)，pH值為6.5～7.0。所有試劑都為分析純，購自北京化學試劑公司。

1.2 添加酚酸物質(zhì)丙酮丁醇發(fā)酵實驗方法

將阿魏酸、香草酸、丁香酸、對羥基苯甲酸標準品按照 0.05、0.1、0.3、0.5、1.0 g/L 濃度加入葡萄糖培養(yǎng)基，按照10%接種量接入活化24 h后的菌種，37℃ 在厭氧培養(yǎng)箱(YQX-II上海新苗醫(yī)療器械制造公司)中靜置培養(yǎng)。測定48 h和120 h時丁醇產(chǎn)量及生物量。

1.3 汽爆玉米秸稈酶解液不脫毒直接丁醇發(fā)酵實驗過程

汽爆玉米秸稈酶解液中含有總酚酸1.21 g/L(采用紫外可見分光光度法，按照王琳等方法進行［12］)，補糖至總糖60 g/L，按照1.1節(jié)中方法將其他營養(yǎng)物質(zhì)補全。分別按照體積分數(shù)10%、20%、30%、50%接種量接入活化24 h的菌種，37℃ 在厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)120 h后測定全部實驗組丁醇產(chǎn)量。

1.4 丁醇產(chǎn)量及生物量檢測方法

丁醇產(chǎn)量采用安捷倫GC-7890A型號氣相色譜進行測定，毛細管柱為Innowax 19091N-113，30 m×0.32 mm×0.25 mm，氫火焰檢測器，載氣為氮氣，氮氣和氫氣的流速比為10∶1，氮氣、氫氣和空氣3種氣體總壓力為1.2 kg/cm2。測定條件:進樣器和檢測器溫度均為250℃，柱箱初始溫度為85℃，維持4.5 min后，以20℃/min的速度升至170℃ 并保持2.5 min，以異丁醇為內(nèi)標物。生物量采用比色法，按照Wang等［13］的方法使用紫外分光光度計(UVmini-1240日本島津)進行測定。

1.5 物性計算方法

IC50定義為丁醇產(chǎn)量為對照組一半時所對應的酚酸含量，通過劃線法得到［14］，logP、pKa由Chemoffice軟件計算得到，相關(guān)系數(shù)由軟件SPSS17計算得到。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌生長與代謝的影響

4種酚酸物質(zhì)對丁醇產(chǎn)量和生物量的影響如圖1～圖2所示。從圖1(a)中可以看出，48 h時實驗組丁醇產(chǎn)量均低于對照組(酚酸添加量為0的組)，但從圖1(b)中可以看出，120 h時隨著酚酸濃度的增加，4個實驗組丁醇產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中阿魏酸組丁醇產(chǎn)量最高點為100 mg/L濃度時，為15.43 g/L，比對照13.51 g/L高出14.21%，而大于100 mg/L開始丁醇產(chǎn)量迅速下降，1 000 mg/L時，丁醇產(chǎn)量為1.15 g/L，抑制率達到91.49%;香草酸組最高點為100 mg/L濃度，為14.30 g/L，比對照13.51 g/L高出5.85%，而大于100 mg/L丁醇產(chǎn)量迅速下降，1 000 mg/L時，丁醇產(chǎn)量為0.45 g/L，抑制率達到 96.67%。丁香酸組最高點為 100 mg/L濃度，為 14.63 g/L，比對照 13.51 g/L高出8.29%，而大于100 mg/L丁醇產(chǎn)量迅速下降，1 000 mg/L時，丁醇產(chǎn)量為 1.01 g/L，抑制率達到92.52%。對羥基苯甲酸組與其他3組都不同的是最高點為50 mg/L濃度為16.39 g/L，比對照13.51 g/L高出21.32%，且100 mg/L也要比對照高。而大于100 mg/L丁醇產(chǎn)量迅速下降，1 000 mg/L時，丁醇產(chǎn)量為0.45 g/L，抑制率達到96.08%。

從圖2(a)中可以看出在48 h時，實驗組生物量低于對照組，這說明丙酮丁醇梭菌生長前期被酚酸物質(zhì)抑制，但是酚酸物質(zhì)量少時，抑制較弱。從圖2(b)中可以看出，120 h時實驗組生物量與丁醇產(chǎn)量趨勢一致，呈現(xiàn)先增后減趨勢，低劑量的酚酸物質(zhì)不僅促進了丁醇的產(chǎn)量，也促進了丙酮丁醇梭菌的繁殖，100 mg/L香草酸組其生物量是對照組的4.50倍。但是酚酸物質(zhì)濃度增大到一定程度，對菌體生長也將產(chǎn)生抑制效果，4個實驗組在1 000 mg/L時，生物量都為0，生長被完全抑制。

從上述結(jié)果可以看出，低劑量的酚酸物質(zhì)對于丁醇產(chǎn)量和丙酮丁醇梭菌生物量起到促進作用，加入50 mg/L對羥基苯甲酸的實驗組促進作用最明顯，丁醇產(chǎn)量比對照組(酚酸添加量為0)高21.32%，但是隨著抑制物濃度再次增加時，會呈現(xiàn)明顯的抑制作用，如香草酸濃度為1 000 mg/L時，抑制率達到96.67%。這是一種低劑量促進效應［15］，高劑量的毒性物質(zhì)起到抑制作用，而低劑量時會起到一定的促進作用，該效應主要應用于醫(yī)學及環(huán)保毒理評價中［16］，未見有國內(nèi)外文獻報道其在發(fā)酵抑制物方面的應用。酚酸物質(zhì)在丁醇發(fā)酵中呈現(xiàn)低劑量興奮效應，推測其原因為:從菌株個體角度看，加入少量酚酸物質(zhì)時，活力較差的菌株會因為酚酸物質(zhì)的毒性被淘汰掉，剩下的高活力菌株則能得到更多的營養(yǎng)進行繁殖和代謝，但此時整體來看還是部分被抑制，所以48 h實驗組的生物量會低于對照組;接下來高活力菌體大量繁殖后，單個細菌所承受的抑制壓力減少，抑制得以解除，而此時的菌體高活性菌株占主體，所以從整體來看，丙酮丁醇梭菌的總體的活性便增強了，即呈現(xiàn)出促進作用;若酚酸濃度過低，其篩選高活力菌株的作用不明顯，其促進作用就較弱，所以除去對羥基苯甲酸實驗組的其它3組中，50 mg/L組的丁醇產(chǎn)量均比100 mg/L組低;而酚酸濃度過高時，高活力的菌株也會被嚴重抑制，所以整體菌株的生長和代謝都受到嚴重影響，濃度足夠高時，則完全停止生長［17-18］，所以酚酸濃度大于100 mg/L并逐漸增加時，丁醇產(chǎn)量和丙酮丁醇梭菌生物量逐漸減少，直至降至0。據(jù)此分析，可以通過增加菌體量降低抑制物濃度，來解除抑制，將酚酸濃度控制到合適濃度時，甚至可以起到促進作用。

2.2 汽爆玉米秸稈酶解液不脫毒直接丁醇發(fā)酵工藝

圖3 不同接種量對不脫毒直接丁醇發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different inoculation rates on butanol yield in butanol fermentation

從圖3中可以看出，隨著接種量(120 h時)從10% 增加至30%，丁醇產(chǎn)量逐漸增加，這是因為增大接種量時，發(fā)酵液被一定程度稀釋，而且由于接入的菌體量大，平均每個菌體所受到的抑制降低，整體的抑制也逐漸降低，代謝增強，所以丁醇產(chǎn)量逐漸增加，接種量30% 時，丁醇產(chǎn)量達到9.16 g/L，達到了一般文獻中報道的丁醇產(chǎn)量［19］;而接種量為50% 時，其丁醇產(chǎn)量低于接種量30% 組，是因為此時稀釋濃度過大，酚酸的低劑量促進作用不明顯，且培養(yǎng)基中的碳源一定，即產(chǎn)物總量一定，發(fā)酵液體積增加，必然丁醇濃度降低。

此結(jié)果說明，通過增大接種量實現(xiàn)木質(zhì)纖維素水解液的不脫毒直接丁醇發(fā)酵是可行的，30%接種量是比較合適的條件。

2.3 木質(zhì)素中酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌的毒性與其物性的關(guān)系

不同的酚酸物質(zhì)其影響趨勢一致，但其低劑量效應轉(zhuǎn)折點，即其對于丙酮丁醇梭菌的毒性不盡相同，為了考察不同酚酸對與丙酮丁醇梭菌毒性大小的影響因素，考察了IC50值與logP、pKa和分子量之間的相關(guān)性。

IC50定義為丁醇產(chǎn)量為對照一半時的酚酸含量，IC50越小，其毒性越強，即較低的濃度就可產(chǎn)生較強的抑制。logP為正辛烷/水分配系數(shù)，代表了這種物質(zhì)的疏水性大小，該數(shù)值越大，其疏水性越大。pKa為電離常數(shù)項，體現(xiàn)了分子的電子效應，pKa反映分子的釋質(zhì)子能力，pKa越大，釋質(zhì)子能力越弱，表明親核性越強。相反，pKa越小，釋質(zhì)子能力越大，表明親電性越強。

由表1可知，IC50與logP相關(guān)性為-0.286，不顯著負相關(guān);IC50與pKa相關(guān)性為0.816，顯著正相關(guān);與分子質(zhì)量相關(guān)系數(shù)為0.876，顯著正相關(guān)。由以上數(shù)據(jù)可以看出酚酸物質(zhì)其毒性與電離常數(shù)和分子質(zhì)量相關(guān)性非常大，都大于0.8，電離常數(shù)越小，分子質(zhì)量越小，IC50越小，即毒性越大，分析原因可能是分子質(zhì)量越小越容易進入細胞內(nèi)，且親核性強，不易被胞內(nèi)物質(zhì)反應掉，毒性持久。與疏水性呈現(xiàn)不顯著的負相關(guān)。根據(jù)理論分析，logP越大，即疏水性越強，其對于細菌細胞膜侵害性會越強，IC50會越小，與上述負相關(guān)數(shù)據(jù)一致，但是相關(guān)系數(shù)較小，說明疏水性大小對于細菌的毒性影響相對較小，文獻中報道酚酸對于大型蚤的影響logP大于pKa的影響［20］，本研究結(jié)果正好相反，分析是因為丙酮丁醇梭菌與大型跳蚤的結(jié)構(gòu)不一樣。定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure activity relationships，QSAR)主要應用于環(huán)境毒理學及藥物設計［21-22］，未見有文獻報道將其用于評價酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌毒性。

表1 4種酚酸物性參數(shù)及其IC50值Table 1 Material parameters and their IC50 values of four kinds of phenolic acids

3 結(jié)論

3.1 木質(zhì)素中酚酸物質(zhì)在低濃度下對丙酮丁醇梭菌生長與代謝具有促進作用，酚酸濃度達到一定時才有抑制作用;建立了通過加大接種量增強菌體抑制點不必脫毒直接進行發(fā)酵的新工藝。

3.2 作者將定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)應用到評價酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌毒性大小，為判斷不同物質(zhì)對于丁醇發(fā)酵毒性大小提供了理論依據(jù)。

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