解瑋佳，白 天，李世峰* ，關(guān)文靈，宋 杰，彭綠春，李樹發(fā)，蔡艷飛，陸 琳

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，云南 昆明 650205;2.云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650205;3.云南省花卉工程中心，云南 昆明 650205;4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201)

銹葉杜鵑(Rhododendron siderophyllum)為杜鵑屬(Rhododendron)杜鵑亞屬(Subgen.Rhododendron)杜鵑組(Sect.Rhododendron)三花杜鵑亞組(Subsect.Triflora)植物［1］，其具有花期早，移栽成活率高等特點(diǎn)［2］，是選育早花杜鵑品種的優(yōu)良種質(zhì)資源。作為育種材料，了解其自交親和性和自花授粉結(jié)實(shí)率等生殖生物學(xué)特性，對于雜交育種工作的順利進(jìn)行至關(guān)重要。近年來，利用胼胝質(zhì)熒光反應(yīng)觀察榛子(Corylus avellana)［3］、蘋果(Malus pumila)［4］等植物的花粉和雌蕊相互作用以檢測其自交親和性的研究已有報道，而在杜鵑花上尚未有相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)采用苯胺藍(lán)熒光顯微技術(shù)對銹葉杜鵑自交授粉后花粉在其花柱中的生長過程進(jìn)行觀察，對其自交親和性進(jìn)行鑒定，旨在為今后開展銹葉杜鵑的雜交育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來自位于昆明阿子營鄉(xiāng)N 25°23'、E 102°73'，海拔2 240～2 270 m地帶的銹葉杜鵑自然居群。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 自花授粉 2012年3月8日—9月17日，選取生長健壯的植株，在松蕾期去雄，然后套硫酸紙袋隔離，并將不同植株上摘下的花藥分別收集在不同的干凈硫酸紙袋中，做好標(biāo)記，帶回室內(nèi)，置于通風(fēng)處陰干，待花粉散出后，帶回野外進(jìn)行同株自交授粉，授粉后再套硫酸紙袋隔離。授粉花朵數(shù)不低于150朵花。

1.2.2 熒光顯微鏡觀察 花柱壓片參照Williams等［7］的方法，分別取自花、異花授粉后2，4，8，12，24，48，76 h雌蕊放入 FAA 固定液(V(甲醛)∶V(冰醋酸)∶V(70%乙醇)=1∶1∶18)中固定4 h，隨后轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)70%的酒精中，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。壓片前，將固定后雌蕊用蒸餾水沖洗至無色，放入4 mol/L NaOH溶液中60℃軟化2 h，用蒸餾水沖洗至無色，用0.1%水溶性苯胺藍(lán)染色48 h?？v向剖取1/2雌蕊及子房，將材料放置于載玻片中央，吸水并滴加1～2滴甘油，蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下觀察。在Leica熒光顯微鏡觀察下觀察花粉萌發(fā)、花粉管生長及受精情況。每張切片取3個視野統(tǒng)計花粉管萌發(fā)率，測量花粉管長度。每處理觀察15朵花。

1.2.3 坐果率 以田間套袋雜交授粉的方式處理不少于50朵花，待花柱枯萎后去袋，授粉后3周統(tǒng)計果實(shí)膨大率，授粉后3個月統(tǒng)計結(jié)實(shí)率。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 銹葉杜鵑自花授粉柱頭上花粉萌發(fā)及花粉管生長的熒光顯微鏡觀察

從銹葉杜鵑自花授粉后花粉萌發(fā)和花粉管生長的熒光顯微鏡觀察來看，授粉后2 h銹葉杜鵑的花粉開始在柱頭上萌發(fā)，花粉管伸長，并纏結(jié)在柱頭乳突細(xì)胞周圍，以此同時，銹葉杜鵑的柱頭乳突組織上出現(xiàn)了大量的胼胝質(zhì)沉積(圖1，1);授粉后4 h，銹葉杜鵑的花粉大量萌發(fā)(圖1，2);授粉后8 h，花粉管進(jìn)入花柱組織，花粉管中出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)(圖1，3)，授粉后12 h，部分花粉管在花柱組織中發(fā)生異常纏繞現(xiàn)象(圖1，4);授粉后24 h，銹葉杜鵑的花柱通道組織中出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)沉積(圖1，5)，花粉管出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)塞(圖1，6)和不規(guī)則胼胝質(zhì)沉積(圖1，7);授粉48 h后，花粉管進(jìn)入子房，子房引導(dǎo)組織出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)沉積(圖1，8)，部分花粉管出現(xiàn)粗細(xì)不均現(xiàn)象(圖1，9);授粉后76 h，胚珠內(nèi)出現(xiàn)多處胼胝質(zhì)的異常沉積(圖1，10)，花粉管進(jìn)入胚珠(圖1，11)，部分花粉管在進(jìn)入珠孔時發(fā)生逆向生長(圖1，12)。

Fig.1 銹葉杜鵑自花授粉的花粉萌發(fā)，花粉管生長及受精情況Fig.1 Pollens germination，growth and fertilization in Rhododendron siderophyllum self-cross

2.2 銹葉杜鵑自花授粉的花粉管生長速度

從花粉管的生長速度來看(圖2)，銹葉杜鵑自花授粉的花粉管平均生長速度為4.39 μm/min，生長速度呈先快后慢趨勢，在授粉后2～12 h這一時段內(nèi)生長較快，而在授粉后12～76 h生長較為緩慢。

從授粉后不同時間花粉管到達(dá)的位置來看(表1)，在授粉后2～8 h的時間段內(nèi)，花粉管均處于花柱上部，而在授粉后12 h，花粉管到達(dá)花柱中部，授粉后24～48 h，花粉管伸長至花柱下部，直至授粉后76 h，花粉管才進(jìn)入子房。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，銹葉杜鵑自花授粉后花粉管在授粉后的2～12 h內(nèi)在花柱上部迅速生長，而在此后的64 h內(nèi)，在花柱中下部緩慢生長，最終到達(dá)子房。

圖2 銹葉杜鵑自花授粉后不同時間的花粉管生長情況Fig.2 Pollen-tube growth in the different time after self-cross of Rhododendron siderophyllum

2.3 銹葉杜鵑自花授粉坐果率

對銹葉杜鵑161朵花進(jìn)行自花授粉，僅有32朵結(jié)實(shí)，坐果率為19.89%，從結(jié)果可以看出，銹葉杜鵑能接受自身花粉并坐果，表現(xiàn)為自交親和性。

表1 銹葉杜鵑自花授粉的花粉管生長情況Tab.1 Pollen germination，pollen-tube growth of Rhododendron siderophyllum after self-cross

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)表明，銹葉杜鵑自花授粉中花粉能夠在柱頭上正常萌發(fā)，花粉管能夠在花柱通道內(nèi)順利生長，且在76 h內(nèi)可以到達(dá)子房，完成受精，熒光顯微觀察的結(jié)果說明銹葉杜鵑自交親和。而銹葉杜鵑的田間自花授粉坐果率為19.89%，實(shí)際驗(yàn)證了銹葉杜鵑的自交親和性。但是，在熒光顯微觀察中發(fā)現(xiàn)，銹葉杜鵑的柱頭在自花授粉后2 h就出現(xiàn)了乳突細(xì)胞的胼胝質(zhì)反應(yīng)，說明銹葉杜鵑在自交過程中仍然存在排斥現(xiàn)象。與此同時，在銹葉杜鵑的花粉管生長過程中，從柱頭乳突細(xì)胞開始到花粉管、花柱通道細(xì)胞、子房引導(dǎo)組織、胚珠的胚囊等都伴隨出現(xiàn)一系列的胼胝質(zhì)反應(yīng)。Williams等［5］研究認(rèn)為，杜鵑花種間雜交不親和障礙有7類，即花粉萌發(fā)失敗;花粉管在柱頭表面發(fā)生異常;花粉管在花柱引導(dǎo)組織內(nèi)發(fā)生異常;花粉管無法達(dá)到子房;花粉管無法進(jìn)入珠孔;花粉管無法進(jìn)入胚囊及花粉管無法釋放精細(xì)胞至胚囊。本實(shí)驗(yàn)中觀察到銹葉杜鵑自花授粉后，其花粉管生長過程中出現(xiàn)花粉管在花柱引導(dǎo)組織內(nèi)纏繞、粗細(xì)不均，花粉管無法進(jìn)入珠孔等幾種異常，實(shí)驗(yàn)表明在銹葉杜鵑自身存在多處屏障來阻礙其自交花粉管的生長，以此抑制其自交親和。銹葉杜鵑自交過程中，授粉后的12～76 h花粉管的生長速度明顯慢于授粉初期，這與王浩等［4］、李天忠等［6］觀察到的蘋果自花授粉花粉管生長到花柱中部之前被抑制的研究結(jié)果不一致，說明銹葉杜鵑抑制其自交的過程主要發(fā)生在授粉后期。Williams等［7］認(rèn)為絕大部分的杜鵑花完全自交親和，少數(shù)種類自交少結(jié)實(shí)或不結(jié)實(shí)是由合子胚敗育引起。從本次試驗(yàn)結(jié)果來看，銹葉杜鵑自交過程中花粉萌發(fā)和花粉管生長基本正常，胚珠受精率達(dá)44.8%(未發(fā)表數(shù)據(jù))，遠(yuǎn)高于銹葉杜鵑的田間坐果率19.89%，而這是否與合子胚敗育有關(guān)還需今后做石蠟切片進(jìn)一步研究。

本次試驗(yàn)結(jié)果證明，銹葉杜鵑具有自交親和特性，在雜交育種中作為雜交親本材料必須及時進(jìn)行去雄套袋處理，以避免出現(xiàn)自交結(jié)實(shí)而影響雜交育種工作的順利進(jìn)行。

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