劉純新，于麗娜，楊力，聶晶磊，陳琳，殷雅丹

中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境保護(hù)部化學(xué)品登記中心，北京 100012

化學(xué)品快速生物降解性經(jīng)典測(cè)試方法的要點(diǎn)比對(duì)

劉純新，于麗娜，楊力*，聶晶磊，陳琳，殷雅丹

中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境保護(hù)部化學(xué)品登記中心，北京 100012

通過(guò)分析六種經(jīng)典快速生物降解性測(cè)試方法的試驗(yàn)原理、操作特點(diǎn)以及限制因素，指出最好根據(jù)受試物對(duì)活性污泥呼吸抑制的EC50和EC20值，選擇試驗(yàn)方法、受試物濃度和接種物濃度。比對(duì)了各方法在受試物適用濃度范圍、接種物來(lái)源和前處理、無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的配制和預(yù)處理、質(zhì)量控制等方面的要求，指出快速生物降解性測(cè)試嚴(yán)禁接種物在接種前接觸受試物；接種微生物的來(lái)源可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大；各方法需要的接種物濃度不同，建議采用平板計(jì)數(shù)方法確定并調(diào)整細(xì)菌數(shù)；對(duì)接種物和培養(yǎng)基進(jìn)行有效的預(yù)處理，可減少空白值。應(yīng)注意防止濾膜過(guò)濾和離心過(guò)程產(chǎn)生的有機(jī)碳干擾DOC的分析。列舉了測(cè)試過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題，強(qiáng)調(diào)應(yīng)根據(jù)降解曲線分析試驗(yàn)結(jié)果；盡快研發(fā)跨區(qū)域、多來(lái)源的標(biāo)準(zhǔn)接種物。

化學(xué)品；快速生物降解性；測(cè)試方法；操作要點(diǎn)；比對(duì)

化學(xué)品快速生物降解性是受試物(有機(jī)物)在限定時(shí)間內(nèi)與接種微生物接觸，表現(xiàn)出的生物降解能力[1]，是鑒別化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境危害性和持久性，進(jìn)行分類和標(biāo)簽[2]，評(píng)價(jià)和控制環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[3]的基本指標(biāo)。若通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法得到的測(cè)試結(jié)果表明該受試物在環(huán)境中可被迅速地生物降解，則列為“易生物降解”類物質(zhì)[1]。國(guó)際上普遍采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)的六種經(jīng)典快速生物降解性測(cè)試方法[4]，分別為：溶解性有機(jī)碳(DOC)消減試驗(yàn)(301A)，二氧化碳(CO2)產(chǎn)生試驗(yàn)(301B)，改進(jìn)的MITI試驗(yàn)(I)(301C)，密閉瓶試驗(yàn)(301D)，改進(jìn)的OECD篩選試驗(yàn)(301E)和呼吸計(jì)量法試驗(yàn)(301F)。歐盟在2008年實(shí)施的《關(guān)于化學(xué)品注冊(cè)、評(píng)估、許可與限制(REACH)法規(guī)》和EC 4402008法規(guī)[5]將這六種經(jīng)典方法寫入技術(shù)法規(guī)(相當(dāng)于我國(guó)的強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn))的C.4部分，要求進(jìn)口到歐盟成員國(guó)的化學(xué)品提交這些測(cè)試數(shù)據(jù)。

我國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2008年分別將OECD的六種經(jīng)典方法等同轉(zhuǎn)化為六項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[8-13]，概述各方法技術(shù)要點(diǎn)的GBT 27850—2011《化學(xué)品 快速生物降解性 通則》于2012年8月1日實(shí)施[14]。OECD于2006年在“301B：二氧化碳(CO2)產(chǎn)生試驗(yàn)”基礎(chǔ)上推出的新方法“310：密閉瓶二氧化碳(頂空試驗(yàn))法”[15]，目前尚未轉(zhuǎn)化為我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)。

2011年12月1日實(shí)施的《危險(xiǎn)化學(xué)品安全管理?xiàng)l例》[16]規(guī)定，環(huán)境保護(hù)主管部門負(fù)責(zé)組織化學(xué)品的環(huán)境危害性鑒定和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)程度評(píng)估。2011年10月《國(guó)務(wù)院關(guān)于加強(qiáng)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)工作的意見(jiàn)》(國(guó)發(fā)〔2011〕35號(hào))要求把環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估作為危險(xiǎn)化學(xué)品項(xiàng)目評(píng)估的重要內(nèi)容[17]。作為履行上述職責(zé)的基礎(chǔ)，快速生物降解性數(shù)據(jù)的科學(xué)性、可靠性更加受到各方面的關(guān)注。但由于種種原因，目前一些測(cè)試機(jī)構(gòu)出具的快速生物降解性測(cè)試數(shù)據(jù)質(zhì)量不高，影響了鑒定和評(píng)估結(jié)果的科學(xué)性。

針對(duì)常見(jiàn)的問(wèn)題，結(jié)合制訂測(cè)試方法標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)OECD的六種經(jīng)典測(cè)試方法的技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)研究。其中，儀器設(shè)備、試驗(yàn)用水、受試物前處理、取樣等操作要點(diǎn)參見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。筆者重點(diǎn)討論六種經(jīng)典方法的受試物濃度范圍、接種微生物的選擇、培養(yǎng)基成分等操作要求和注意事項(xiàng)，以期引起同行的關(guān)注。

1 對(duì)受試物濃度范圍的要求

六種經(jīng)典測(cè)試方法由于原理和所用儀器設(shè)備的不同，對(duì)受試物濃度的限制因素多，要求也不同(表1)。

表1 六種快速生物降解性測(cè)試方法的受試物濃度

1)理論上受試物濃度為2～10 mgL，但對(duì)于大多數(shù)受試物，當(dāng)濃度超過(guò)5 mgL時(shí)，瓶中溶解氧不能滿足降解需要；2)對(duì)ThOD值低的物質(zhì)。

301A和301E兩種方法只能測(cè)試易溶于水、難揮發(fā)、不易吸附的物質(zhì)。反應(yīng)容器用鋁箔封口，內(nèi)外空氣可以自由交換，通過(guò)在恒溫振蕩器上振蕩維持試驗(yàn)溶液中的溶解氧[18]。受復(fù)氧速率和DOC分析精度等因素限制，反應(yīng)容器中受試物的DOC濃度應(yīng)控制在10～40 mgL[8,12,19]。

301B用脫CO2的空氣曝氣，復(fù)氧速率和溶解氧濃度可以得到保證。該方法用Ba(OH)2或NaOH溶液吸收生化反應(yīng)產(chǎn)生的CO2，通過(guò)滴定剩余堿液或測(cè)定無(wú)機(jī)碳計(jì)算CO2的濃度，進(jìn)而計(jì)算受試物的降解率。如果反應(yīng)容器中有機(jī)碳濃度過(guò)低，將影響測(cè)試精度；如果有機(jī)碳濃度過(guò)高，將增加CO2吸收瓶的數(shù)量，以及Ba(OH)2或NaOH的用量。因此，該方法反應(yīng)容器中受試物的有機(jī)碳濃度(DOC或總有機(jī)碳TOC，難溶物質(zhì)以懸浮液計(jì))應(yīng)控制在10～20 mgL。對(duì)于難溶物質(zhì)，試驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)磁力攪拌保持懸浮狀態(tài)[9]。

經(jīng)典的301C采用專用的MITI測(cè)定儀，配備六個(gè)燒瓶在密閉條件下進(jìn)行磁力攪拌，通過(guò)電解瓶電解CuSO4溶液產(chǎn)生的氧氣補(bǔ)充消耗的溶解氧。該方法可測(cè)試難溶于水、易吸附及易揮發(fā)的化學(xué)物質(zhì)；但對(duì)于易揮發(fā)性物質(zhì)，應(yīng)注意盡量減小試驗(yàn)燒瓶上部氣體空間的體積；因采用電解法連續(xù)供氧系統(tǒng)，因此該方法基本不受溶解氧變化的限制?？蛇x擇較高的受試物濃度，一般地，受試物濃度設(shè)定為100 mgL(難溶物質(zhì)以懸浮液計(jì))[10]。

301D以BOD瓶作為反應(yīng)容器，瓶中充滿試驗(yàn)液體后密閉，無(wú)外界供氧。受瓶中液體溶解氧的總量限制，且為保證溶解氧測(cè)定精度，應(yīng)始終保持DO濃度≥0.5 mgL，受試物濃度一般控制在2～5 mgL，對(duì)于不易降解或理論需氧量(ThOD)低的物質(zhì)，可提高到5～10 mgL。對(duì)于缺乏毒性信息，且未預(yù)先測(cè)試活性污泥呼吸抑制作用[20-21]的受試物，為得到可靠的測(cè)試結(jié)果，最好選擇2和5 mgL兩個(gè)受試物濃度同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。只要其中一個(gè)濃度的試驗(yàn)在10 d觀察期或14 d達(dá)到通過(guò)水平，即可認(rèn)為該受試物具有快速生物降解性。對(duì)于含氮的受試物，需校正硝化作用的影響[11,18]。

301F與301C原理相似，都是受試物在密閉條件下進(jìn)行磁力攪拌，用CO2吸收劑吸收產(chǎn)生的CO2。二者不同之處在于，301F根據(jù)所使用呼吸計(jì)的廠家、型號(hào)的不同，可測(cè)量電解產(chǎn)生的氧氣量，也可測(cè)量容器內(nèi)氣體壓力的變化；能連續(xù)測(cè)量并記錄，也能定期、間歇測(cè)定。因此301F受試物濃度(難溶物質(zhì)以懸浮液計(jì))與301C相似，一般為100 mgL，但ThOD要保持在50～100 mgL[13]。如果使用無(wú)供氧裝置的BOD測(cè)定儀(WTW Oxitop 110C或Lovibond ET99724A系列)作為呼吸計(jì)，要特別注意試驗(yàn)液體體積、預(yù)留頂空氧氣的量，在保證溶解氧濃度的前提下，計(jì)算受試物濃度。對(duì)于含氮的受試物，計(jì)算ThOD時(shí)需校正硝化作用的影響。

2 各測(cè)試方法對(duì)接種物來(lái)源的要求

2.1 301A、301B和301F接種物的來(lái)源

301A、301B和301F方法原則上都可采用多種來(lái)源的接種微生物：活性污泥、污水處理廠出水、地表水、土壤，或以上幾種的混合物。建議采用平板計(jì)數(shù)等方法，對(duì)采集的地表水進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確保接種后的試驗(yàn)培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)為107～108個(gè)L[8-9,13,19]。

2.1.1 活性污泥接種物

選擇以處理生活污水為主、正常運(yùn)轉(zhuǎn)的普通活性污泥法的城市污水處理廠或中試規(guī)模的處理設(shè)施，從曝氣池中取新鮮的活性污泥樣品[19]作為接種物。

2.1.2 其他來(lái)源的接種物

可選擇以處理生活污水為主的污水處理廠或中試規(guī)模的處理設(shè)施，從二沉池中取未經(jīng)滅菌處理的二級(jí)出水作為接種物。

也可采集河水、湖水等地表水樣品作為接種物。若菌落計(jì)數(shù)達(dá)不到要求，可采用過(guò)濾或離心等方式進(jìn)行濃縮。

由于不同來(lái)源的接種物中微生物種類存在差異，對(duì)于某些受試物，得出的快速生物降解性測(cè)試結(jié)果差異較大。鑒于處理生活污水的污水處理廠的活性污泥中微生物種類豐富，且采用活性污泥得出的測(cè)試結(jié)果更適用于評(píng)價(jià)該受試物排放后對(duì)水環(huán)境的影響，因此，301A、301B和301F首選活性污泥作為接種物。

2.2 301C接種物的來(lái)源

301C最大的特點(diǎn)是采用標(biāo)準(zhǔn)化的復(fù)合接種物。經(jīng)典的301C由日本通產(chǎn)省[19]提出，采用日本化學(xué)物質(zhì)測(cè)試中心提供的標(biāo)準(zhǔn)接種物。該標(biāo)準(zhǔn)接種物是每個(gè)季度在日本十個(gè)場(chǎng)所(兩個(gè)內(nèi)海、一個(gè)湖泊、一個(gè)化工廢水處理廠以及分別位于日本南部、中部、北部的三個(gè)城市污水處理廠和三條河流)采集地表水、土壤和活性污泥，混合、培養(yǎng)而成[19,22-23]。該標(biāo)準(zhǔn)接種物中的微生物種類多，活性相對(duì)穩(wěn)定，適應(yīng)范圍廣，能夠代表日本各區(qū)域的微生物特性，日本的測(cè)試機(jī)構(gòu)大多采用301C和標(biāo)準(zhǔn)接種物測(cè)試化學(xué)品的快速生物降解性。我國(guó)相關(guān)單位相應(yīng)開(kāi)展了一些研究，但目前尚未推出標(biāo)準(zhǔn)的接種物；采用301C的實(shí)驗(yàn)室往往在所在城市選10個(gè)地點(diǎn)，采集微生物作為接種物。

2.3 301D接種物的來(lái)源

301D由于BOD瓶?jī)?nèi)外沒(méi)有氣體交換，受BOD瓶中液體溶解氧的總量限制，要求細(xì)菌數(shù)為104～106個(gè)L，只能接種采自生活污水處理廠未經(jīng)滅菌處理的二級(jí)出水或地表水，首選二級(jí)出水[11]。如果加入細(xì)菌濃度過(guò)高的污水，或直接用活性污泥接種，由于內(nèi)源呼吸耗氧量大，測(cè)試過(guò)程中空白對(duì)照組的溶解氧濃度下降超過(guò)1.5 mgL，或試驗(yàn)組瓶中溶解氧濃度低于0.5 mgL，會(huì)掩蓋受試物的降解情況或影響受試物的降解反應(yīng)，導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。

2.4 301E接種物的來(lái)源

301E要求選擇以處理生活污水為主的污水處理廠或中試規(guī)模的處理設(shè)施，從二沉池中取未經(jīng)滅菌處理的二級(jí)出水進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確保接種后的每L試驗(yàn)培養(yǎng)基中細(xì)菌的數(shù)量級(jí)為105[12]。

不同地區(qū)的城市污水處理廠，微生物相會(huì)存在差異。同一城市處于不同運(yùn)行狀態(tài)的污水處理廠，微生物相的差異也很大。若采用主要處理工業(yè)廢水的污水處理廠的活性污泥作為接種物，得出的降解率可能會(huì)偏低。采集接種物之前，應(yīng)詳細(xì)調(diào)查備選污水處理廠運(yùn)行是否穩(wěn)定，及其所處理的生活污水、工業(yè)廢水的成分和所占比例。

各測(cè)試方法接種微生物的來(lái)源和接種物濃度如表2所示。

表2 各測(cè)試方法接種微生物的來(lái)源和接種物濃度

1)SS為懸浮固體；2)以每個(gè)季度在日本10個(gè)場(chǎng)所收集的地表水、土壤和活性污泥，混合、培養(yǎng)1～3個(gè)月而成。

3 接種物前處理

所有快速生物降解性測(cè)試方法的接種物都不對(duì)受試物進(jìn)行馴化。在正式試驗(yàn)的接種前，嚴(yán)格避免接種物與受試物接觸[19]。

3.1 301A、301B和301F接種物的前處理

3.1.1 活性污泥接種物

從曝氣池中取新鮮的活性污泥樣品后，在運(yùn)輸和處理過(guò)程中應(yīng)一直曝氣，保持有氧狀態(tài)。用細(xì)篩濾除粗糙顆粒后，沉淀或離心分離(一般以相當(dāng)于104ms2或1 100g的轉(zhuǎn)速，離心10 min)，將浮在表面的雜質(zhì)除去。用試驗(yàn)培養(yǎng)基清洗(將活性污泥與試驗(yàn)培養(yǎng)基充分混合后，沉淀或離心分離，去掉懸浮物和上層液體；用過(guò)量的試驗(yàn)培養(yǎng)基懸浮洗過(guò)的活性污泥，再沉淀或離心；重復(fù)這一操作直到洗凈、不含抑制細(xì)菌的物質(zhì)為止)，使活性污泥在試驗(yàn)培養(yǎng)基中濃度為3～5 gL，曝氣培養(yǎng)直至使用。

也可用勻漿器以中等速度將活性污泥攪拌2 min，使其分散均勻(SS濃度為3～5 gL)，沉淀30 min，用試驗(yàn)培養(yǎng)基清洗[8]。

為減少試驗(yàn)的空白值，提高試驗(yàn)精度，一般活性污泥應(yīng)在試驗(yàn)溫度下〔(22±2) ℃〕，在試驗(yàn)培養(yǎng)基(無(wú)受試物)中曝氣培養(yǎng)5～7 d。試驗(yàn)前應(yīng)從懸浮污泥中抽取一份樣品，測(cè)定活性污泥的干重。

如果活性污泥不是取自普通活性污泥法的污水處理廠，而是取自其他工藝的高效污水處理廠，或估計(jì)含有抑制細(xì)菌的物質(zhì)，應(yīng)在去除懸浮物后，用試驗(yàn)培養(yǎng)基仔細(xì)清洗活性污泥，直到不含多余的有機(jī)物或抑制性物質(zhì)[19]。

3.1.2 其他來(lái)源的接種物

如果采集未滅菌的二級(jí)出水，在運(yùn)輸中應(yīng)保持有氧狀態(tài)。樣品沉淀1 h或用粗濾紙過(guò)濾后，保持上清液或?yàn)V出液在有氧狀態(tài)直至使用。

如果采集地表水樣品(如河水、湖水)，去除懸浮物和沉淀物后，保持有氧狀態(tài)直至使用。

3.2 301B接種物的前處理

301B的接種物，除了按3.1節(jié)操作外，還應(yīng)在試驗(yàn)開(kāi)始前，在試驗(yàn)容器中加入接種物和培養(yǎng)基后，用脫CO2的空氣長(zhǎng)時(shí)間曝氣，除去其中溶解的CO2后，再加入受試物或參比物。

3.3 301C接種物的前處理

我國(guó)目前尚無(wú)符合301C要求的標(biāo)準(zhǔn)接種物，不同測(cè)試機(jī)構(gòu)往往自行選點(diǎn)采集活性污泥等作為接種物。因此，應(yīng)按301C對(duì)接種物培養(yǎng)和前處理、試驗(yàn)溫度〔(25±1) ℃〕、pH、營(yíng)養(yǎng)成分、曝氣間隔的具體要求操作[10,22-23]。

3.4 301D和301E接種物的前處理

301D和301E，采集污水處理廠未經(jīng)滅菌處理的二級(jí)出水，并在運(yùn)輸中保持有氧狀態(tài)。用粗濾紙過(guò)濾除去懸浮物后，濾出液在試驗(yàn)溫度下曝氣5～7 d。

4 各測(cè)試方法培養(yǎng)基的配制和處理的要求

4.1 培養(yǎng)基的配制

4.1.1 無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽貯備液

先按配方要求配制無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽貯備液，再通過(guò)稀釋制備試驗(yàn)培養(yǎng)基。同一試驗(yàn)所用培養(yǎng)基應(yīng)為同一批配制。試驗(yàn)前，先用分析純?cè)噭┲苽渌姆N貯備液，包括：1)由磷酸鉀鹽和鈉鹽與NH4Cl配制的緩沖溶液(a)；2)CaCl2溶液；3)MgSO4溶液；4)FeCl3溶液。為便于保存FeCl3貯備液，可向每升貯備液加入0.4 g的EDTA，或加入1滴(0.05 mL)濃鹽酸。如貯備液中出現(xiàn)沉淀則不能使用。

301A、301B、301D、301E和301F五種方法要求試驗(yàn)的pH維持為7.4±0.2，緩沖溶液(a)的pH為7.4，采用的鈉鹽為二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)。301C最適pH為7.0，緩沖溶液(a)的pH為7.2，采用的鈉鹽為十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)[19]；NH4Cl的配比也與另外五個(gè)方法不同。

4.1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基

在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，用貯備液和蒸餾水制備試驗(yàn)培養(yǎng)基。雖然301A、301B、301D、301E和301F的貯備液相同，但由于301D的接種微生物濃度低，試驗(yàn)培養(yǎng)基中N、P、K、Na等四種無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素濃度只相當(dāng)于301A、301B、301E和301F等四種方法的110。因此在配制301D的試驗(yàn)培養(yǎng)基時(shí)，要特別注意緩沖溶液(a)的添加量，即按每L試驗(yàn)培養(yǎng)基加入1 mL緩沖溶液(a)的比例配制[11]；而配制301A等四個(gè)方法的試驗(yàn)培養(yǎng)基時(shí)，相應(yīng)的緩沖溶液(a)的量為10 mL。

301E中，要求按每L試驗(yàn)培養(yǎng)基加入污水處理廠二級(jí)出水的濾出液0.5 mL的比例接種，接種微生物少，接種帶入的微量元素和生長(zhǎng)因子少，因此該試驗(yàn)培養(yǎng)基需另外補(bǔ)充Mn、B、Mo、Zn等微量元素和酵母浸膏溶液[12]。

301C試驗(yàn)的最佳pH與其他方法不同，不但緩沖溶液的成分配比不同，而且要求在配制試驗(yàn)培養(yǎng)基時(shí)，按每L試驗(yàn)培養(yǎng)基分別加入四種貯備液各3 mL的比例操作[10]。

六種快速生物降解性測(cè)試方法試驗(yàn)培養(yǎng)基成分和濃度如表3所示。

表3 六種快速生物降解性測(cè)試方法試驗(yàn)培養(yǎng)基成分和濃度

1)301E方法每L培養(yǎng)基中加微量元素溶液和維生素溶液各1 mL。

4.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基的前處理

正式試驗(yàn)前，有些方法需要進(jìn)行前處理。301B要求用脫CO2的空氣或人工配制的標(biāo)準(zhǔn)氣(氧氣與氮?dú)怏w積比為20∶80)對(duì)試驗(yàn)培養(yǎng)基曝氣[9]，驅(qū)除溶解的CO2(注意在試驗(yàn)過(guò)程中，如果用工業(yè)純氧代替脫CO2的空氣，或代替配制的標(biāo)準(zhǔn)氣曝氣，雖然可以簡(jiǎn)化操作，但由于在純氧曝氣條件下，培養(yǎng)基中溶解氧濃度會(huì)顯著提高，微生物的代謝狀態(tài)與在空氣曝氣條件下不同[24]，將影響測(cè)試結(jié)果的可比性)。

301D要求在試驗(yàn)溫度〔(22±2)℃〕下對(duì)試驗(yàn)培養(yǎng)基高強(qiáng)度曝氣20 min以上，使溶解氧飽和，然后靜置20 h達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，測(cè)定溶解氧濃度[11]。用虹吸管移液和裝瓶時(shí)應(yīng)保持試驗(yàn)培養(yǎng)基處于溶解氧飽和且無(wú)氣泡釋放的狀態(tài)。

5 判定試驗(yàn)有效的條件

如果這六種經(jīng)典方法的試驗(yàn)結(jié)果在穩(wěn)定期、10 d觀察期或28 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各平行組間受試物去除量的最大差別小于20％；并且參比物在14 d的降解率達(dá)到通過(guò)水平，才能認(rèn)為有效。只要上述任一條件未滿足，試驗(yàn)應(yīng)重做[14]。

嚴(yán)格地講，不能僅憑受試物降解率數(shù)值低，就斷定受試物在環(huán)境中不能被生物降解，而是需要通過(guò)測(cè)試其固有生物降解性[22,25-26]或模擬環(huán)境降解試驗(yàn)[27-30]來(lái)進(jìn)一步確定其生物降解性。

5.1 301A和301E的有效性

301A和301E試驗(yàn)中，若含有受試物和參比物的毒性對(duì)照組在14 d內(nèi)DOC的去除率小于35％，可認(rèn)為受試物對(duì)細(xì)菌有抑制性。應(yīng)適當(dāng)降低受試物濃度(不能低于檢出限，不能影響DOC測(cè)定的精確性)，重新試驗(yàn)。

對(duì)于301A，還可提高接種物濃度(SS濃度應(yīng)小于30 mgL)，重新試驗(yàn)。

5.2 301B的有效性

試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，試驗(yàn)容器中受試物懸浮液的無(wú)機(jī)碳(IC)濃度必須少于總碳(TC)濃度的5％；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，接種物空白組中，每L培養(yǎng)基產(chǎn)生的CO2總量通常不超過(guò)40 mg，如果超過(guò)70 mg，應(yīng)認(rèn)真檢查接種物的內(nèi)源呼吸情況、是否帶入多余的有機(jī)物、反應(yīng)容器的氣密性、脫CO2曝氣系統(tǒng)、試驗(yàn)操作的全過(guò)程以及全部數(shù)據(jù)。

如果含有受試物和參比物的毒性對(duì)照組在14 d內(nèi)CO2的產(chǎn)生量少于ThCO2的25％，可認(rèn)為受試物對(duì)細(xì)菌有抑制性?？蛇m當(dāng)降低受試物濃度和或提高接種物濃度(SS濃度應(yīng)小于30 mgL)，重新試驗(yàn)。

5.3 301C和301F的有效性

如果反應(yīng)容器中的pH低于6.0或高于8.5，并且受試物氧消耗量少于ThOD的60％，應(yīng)適當(dāng)降低受試物濃度，重新試驗(yàn)。

以苯胺為參比物的程序?qū)φ战M在7和14 d后，用氧消耗量計(jì)算出的苯胺降解率應(yīng)分別超過(guò)40％和65％。否則，應(yīng)重新試驗(yàn)。

5.4 301D的有效性

28 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，接種物空白組的溶解氧與試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)相比，損耗不應(yīng)超過(guò)1.5 mgL。若超過(guò)該值，需要檢查各容器、導(dǎo)管和試驗(yàn)瓶的清洗、培養(yǎng)基的配制和曝氣、接種物的細(xì)菌數(shù)、試驗(yàn)操作是否帶入還原性物質(zhì)等。

在試驗(yàn)過(guò)程中，試驗(yàn)瓶中溶解氧的殘余濃度始終應(yīng)不低于0.5 mgL。如果溶解氧濃度過(guò)低，溶解氧測(cè)定精度降低，而且好氧微生物的活動(dòng)將受到抑制，影響測(cè)試結(jié)果。

如果含有受試物和參比物的毒性對(duì)照組在14 d內(nèi)生物降解耗氧量達(dá)不到ThOD的25％，可認(rèn)為受試物對(duì)細(xì)菌有抑制性。應(yīng)適當(dāng)降低受試物濃度，重做試驗(yàn)。

6 常見(jiàn)問(wèn)題及處理措施

6.1 概念和思路不清楚，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)不當(dāng)

化學(xué)品快速生物降解性測(cè)試(特別是301C、301D、301F)與廢水生化需氧量(BOD)測(cè)試有相似之處，但在測(cè)試目的、原理、周期、操作等方面差別很大。如果301C和301F使用自動(dòng)BOD測(cè)定儀(如WTW OxiTop 110C、Lovibond ET99724A系列)作為呼吸測(cè)定儀，照搬測(cè)定BOD(2 d+5 d)的做法，加烯丙基硫脲(allylthiourea)抑制硝化作用[31-32]，且不核算受試物的ThOD、頂空氧氣量，容易導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。應(yīng)注意，每一種化學(xué)品的降解性測(cè)試都相當(dāng)于一項(xiàng)研究課題，要根據(jù)受試物的物理、化學(xué)、毒理等方面的性質(zhì)，對(duì)試驗(yàn)方案和操作及時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

6.2 缺少或不會(huì)運(yùn)用毒性信息，受試物試驗(yàn)濃度設(shè)置不當(dāng)

多數(shù)情況下，測(cè)試機(jī)構(gòu)缺少或不知如何運(yùn)用受試物對(duì)微生物的毒性信息。若受試物的試驗(yàn)濃度偏高，使細(xì)菌活性受到抑制，導(dǎo)致降解率偏低。該類受試物容易被誤判為難生物降解物質(zhì)。要避免該類問(wèn)題，在測(cè)試快速生物降解性之前，最好測(cè)試該物質(zhì)對(duì)活性污泥呼吸抑制的EC50和EC20值。將快速生物降解性測(cè)試的受試物濃度設(shè)置為EC50的110(或低于EC20)[20-21]。當(dāng)EC50lt;20 mgL時(shí)，為避免影響后續(xù)試驗(yàn)，最好同時(shí)以2個(gè)較低的受試物濃度進(jìn)行301D試驗(yàn)，并設(shè)置毒性對(duì)照組。

6.3 缺乏環(huán)境微生物方面的背景信息，接種微生物來(lái)源選擇不當(dāng)

若為方便，就近取地表水作為接種物，未判斷其中微生物濃度和活性即進(jìn)行試驗(yàn)，往往重現(xiàn)性不好，有時(shí)為陽(yáng)性而有時(shí)為陰性。某些城市污水處理廠工業(yè)廢水比例過(guò)高，活性污泥或二級(jí)出水中細(xì)菌種類較少；或者某些污水處理廠運(yùn)行不穩(wěn)定，細(xì)菌的活性不夠，都會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)此，在選擇接種物前，要周密調(diào)查備選污水處理廠的污水來(lái)源、主要工藝、運(yùn)行狀況等，最好選擇運(yùn)行穩(wěn)定，主要處理生活污水、普通活性污泥法的污水處理廠的活性污泥或二級(jí)出水作接種物。

6.4 不熟悉測(cè)試方法的要領(lǐng)，接種物濃度控制不當(dāng)

若不了解所選測(cè)試方法的原理、供氧方式和復(fù)氧速率，未控制接種物中細(xì)菌濃度，接種物濃度過(guò)高將使試驗(yàn)溶液中缺氧，達(dá)不到質(zhì)控條件(301D尤其突出)。若接種物濃度過(guò)低，由于細(xì)菌種類、數(shù)量少，可能導(dǎo)致停滯期延長(zhǎng)，降解率偏低。301A和301E未要求測(cè)溶解氧；實(shí)際操作中，靠燒瓶振蕩復(fù)氧，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有效性的影響容易被忽視。要解決該類問(wèn)題，掌握各方法、各步操作所涉及的背景知識(shí)是非常必要的；同時(shí)通過(guò)實(shí)際測(cè)定以控制接種物中的細(xì)菌濃度。

6.5 培養(yǎng)基前處理不當(dāng)

實(shí)際測(cè)試中，配制試驗(yàn)培養(yǎng)基后，容易忽視前處理的一些細(xì)節(jié)。若301B中脫CO2的曝氣系統(tǒng)氣密性不好，或曝氣不徹底，不能有效驅(qū)除培養(yǎng)基中溶解的CO2，空白值將偏高。要避免該類問(wèn)題，應(yīng)注意檢查供氣和培養(yǎng)基中是否殘余CO2。

若301D曝氣系統(tǒng)給試驗(yàn)培養(yǎng)基帶入油滴等雜質(zhì)，會(huì)使試驗(yàn)瓶中溶解氧消耗過(guò)快，甚至導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。要避免該類問(wèn)題，應(yīng)慎重選用空壓機(jī)和曝氣管，通過(guò)過(guò)濾等方式，確保供氣的清潔。

6.6 取樣預(yù)處理不當(dāng)

對(duì)于301A和301E等用有機(jī)碳分析儀測(cè)定DOC的方法，如果取樣后用0.45 μm濾膜過(guò)濾，一方面，濾膜表面涂層的親水性物質(zhì)可能進(jìn)入濾出液；另一方面，有些受試物可能與過(guò)濾器、濾膜發(fā)生作用，引起偏差。要減少該類偏差，每次試驗(yàn)前，將過(guò)濾器、濾膜放入去離子水中煮沸三次，每次煮1 h，去除涂層物質(zhì)和溶解性有機(jī)物。還可采取預(yù)飽和等措施，確保過(guò)濾器、濾膜不釋放出溶解性有機(jī)碳、不吸附受試物。

6.7 結(jié)果判斷不當(dāng)

試驗(yàn)結(jié)束，在判斷受試物是否具有快速生物降解性時(shí)，往往關(guān)注28 d的降解率，而忽視降解曲線；甚至在試驗(yàn)前未考慮為繪制降解曲線預(yù)留足夠的取樣點(diǎn)(如每7 d取一次樣，對(duì)于很多受試物無(wú)法繪制出完整的降解曲線，得不出降解趨勢(shì))。要解決該類問(wèn)題，在設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案、分析試驗(yàn)結(jié)果、判斷受試物的降解性時(shí)，應(yīng)考慮整個(gè)降解曲線，明確其停滯期、對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期和平穩(wěn)期?？焖偕锝到庑缘牧N經(jīng)典方法規(guī)定試驗(yàn)周期為28 d，以使接種微生物有足夠的時(shí)間去適應(yīng)受試物，避免因周期短而錯(cuò)過(guò)對(duì)一些受試物降解情況的觀察，同時(shí)確保得到完整的降解曲線。當(dāng)降解率達(dá)到10％(或CO2的產(chǎn)生量達(dá)到ThCO2的10％)，表明生物降解已經(jīng)開(kāi)始，只有在隨后的10 d內(nèi)(301C除外，如果采用14 d觀察期，以試驗(yàn)的第14天計(jì))達(dá)到通過(guò)水平才表明其具有快速生物降解性。如果受試物在經(jīng)過(guò)較短的停滯期后緩慢降解，未在10 d觀察期內(nèi)達(dá)到通過(guò)水平，則不認(rèn)為其具有快速生物降解性。

7 結(jié)論和建議

(1)根據(jù)各方法的原理、設(shè)備、供氧、操作特點(diǎn)，確定最佳的試驗(yàn)方案和受試物濃度。

(2)化學(xué)品對(duì)微生物的毒性和抑制作用，會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的誤判。對(duì)于缺少該類信息的受試物，最好先測(cè)定其對(duì)活性污泥呼吸抑制的EC50和EC20值，再選擇試驗(yàn)方法和接種物濃度。

(3)接種微生物的來(lái)源對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大。301A、301B、301F三種方法最好選擇運(yùn)行良好、主要處理生活污水、普通活性污泥法的污水處理廠或中試裝置的活性污泥；301D和301E兩種方法最好選擇運(yùn)行良好的生活污水處理廠的二級(jí)出水；301C采用多來(lái)源、混合培養(yǎng)的微生物作為接種物。為提高試驗(yàn)的可比性和復(fù)現(xiàn)性，我國(guó)應(yīng)盡快研究推出標(biāo)準(zhǔn)接種物。

(4)所有快速生物降解性測(cè)試的接種物都不對(duì)受試物進(jìn)行馴化，嚴(yán)格避免接種物在接種前與受試物接觸。在試驗(yàn)前，對(duì)接種物和培養(yǎng)基進(jìn)行前處理，充分減少空白值。

(5)接種物濃度過(guò)高、過(guò)低，都會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。各方法需要的接種物濃度不同，最好采用平板計(jì)數(shù)等方法確定細(xì)菌數(shù)，并調(diào)整接種微生物濃度。

(6)對(duì)于301A和301E等需要測(cè)定DOC濃度的方法，取樣后的預(yù)處理，不論采用濾膜過(guò)濾還是高速離心，都要注意防止溶出的有機(jī)碳對(duì)DOC濃度分析的干擾。

(7)應(yīng)重視降解曲線，在設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案時(shí)預(yù)留足夠的取樣點(diǎn)。在分析試驗(yàn)結(jié)果、判斷受試物的降解性時(shí)，應(yīng)考慮其整個(gè)降解曲線，明確其停滯期、對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期和平穩(wěn)期。

[1]國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.化學(xué)品測(cè)試方法[M].北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2004.

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[11]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GBT 21831—2008 化學(xué)品 快速生物降解性 密閉瓶法試驗(yàn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[12]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GBT 21857—2008 化學(xué)品 快速生物降解性 改進(jìn)的OECD篩選試驗(yàn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[13]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GBT 21801—2008 化學(xué)品 快速生物降解性 呼吸計(jì)量法試驗(yàn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[14]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GBT 27850—2011 化學(xué)品 快速生物降解性 通則[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012.

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[30]OECD.Test No.308:aerobic and anaerobic transformation in aquatic sediment systems[EBOL].(2002-04-24)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-308- aerobic-and-anaerobic-transformation-in-aquatic-sediment-systems_ 9789264070523-en.

[31]環(huán)境保護(hù)部.HJ 505—2009 水質(zhì) 五日生化需氧量(BOD5)的測(cè)定 稀釋與接種法[S].北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2009：12.

[32]International Organization for Standardization.ISO 5815-1:2003 Water quality-determination of Ⅱ biochemical oxygen demand after n days (BODn):Part 1.Dilution and seeding method with allylthiourea addition[SOL].Switzerland:International Organization for Standardization,2003.(2003-04-01)[2012-05-18].http:www.iso.orgisoiso_cataloguecatalogue_tccatalogue_detail.htm?csnumber=31090. ○

《環(huán)境工程技術(shù)學(xué)報(bào)》投稿須知

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稿件需要清楚地提出問(wèn)題。對(duì)所研究問(wèn)題的背景，研究工作的目的，主要方法、原理與主要儀器設(shè)備，結(jié)果(包括主要數(shù)據(jù))與分析以及結(jié)論等內(nèi)容有清楚的描述。

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ComparisonsofClassicalTestMethodsofReadyBiodegradabilityforChemicals

LIU Chun-xin, YU Li-na, YANG Li, NIE Jing-lei, CHEN Lin, YIN Ya-dan

Chemical Registration Center of Ministry of Environmental Protection, Chinese Research Academy of Environmental Science, Beijing 100012, China

By analyzing the experimental principle, operating feature and limited factors of six classical test methods of ready biodegradability, it was pointed out that the suited test method, test substance concentration and inoculum concentration had better be selected according to the values ofEC50andEC20of activated sludge from respiration inhibition test. After comparing the requirement on concentration ranges of test substances, source and pre-condition of inoculum, preparation and preliminary treatment of mineral medium, and validity of quality control of the six test methods, it was indicated that inoculum was forbidden to contact test substances before inoculating in all test methods of chemicals for ready biodegradability; different sources of inoculum might impact on test results greatly. Each method required different concentrations of inoculum, and it was suggested that bacteria should be enumerated by using plate-counting techniques and microbial cell densities controlled accordingly. The effective preliminary treatment of inoculum and mineral medium could reduce blank values. It was important to avoid organic carbon generated from filter membrane or centrifugation influence on analyzing DOC concentration. Frequent questions in test process were listed, and it was emphasized that test results should be estimated from degradation curve, and that trans-areas and multi-source standard inoculum should be researched and developed as soon as possible.

chemicals; ready biodegradability; test methods; operation key points; comparison

1674-991X(2013)02-0124-09

2012-06-11

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃項(xiàng)目(20081305-T-469)；國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目(2011-26)

劉純新(1974—)，男，副研究員，碩士，主要從事化學(xué)品污染防治和生態(tài)毒理學(xué)測(cè)試、GLP體系研究，liucx@crc-mep.org.cn

*通訊作者:楊力(1973—)，女，高級(jí)工程師，主要從事化學(xué)品環(huán)境管理研究，yangl@crc-mep.org.cn

X592 X831

A

10.3969j.issn.1674-991X.2013.02.021