郭 潔，張曉雙，劉繼平

(陜西中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，陜西咸陽 712046)

糖尿病腎病是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎功能衰竭的主要原因。流行病學(xué)調(diào)查顯示終末期腎臟病的年發(fā)病率為3.36%，其中糖尿病引發(fā)的慢性腎病占糖尿病患者的一半，而約20%～40%的糖尿病腎病患者進展為終末期腎?。?-2］。現(xiàn)代病理學(xué)研究顯示糖尿病腎病的病理改變?yōu)槟I小球肥大、細胞外基質(zhì)積聚、基底膜增厚，導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化和腎功能衰竭［3］。糖尿病腎病的發(fā)病機制復(fù)雜，其機理尚未完全明白。最新的研究顯示，晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色［4］。AGEs是還原糖與蛋白、脂質(zhì)或核酸的氨基經(jīng)過希夫氏堿反應(yīng)形成的一類化合物，可以激發(fā)炎癥反應(yīng)，造成腎系膜細胞損傷及病變［5］。因此，通過干預(yù)AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減輕腎細胞的損傷成為有效的策略。

環(huán)烯醚萜總苷為山茱萸一類重要的成分。研究顯示，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對糖尿病腎病病變具有保護作用［6］。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能通過抑制氧化應(yīng)激來對抗AGEs誘導(dǎo)的腎系膜損傷作用［7］。除此以外，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能不同程度地減輕腎小球系膜增生、基底膜增厚、糖原沉積以及腎小管空泡透明變性等［6］。但是，對AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)未見報道，且機制也不明確。因此，本研究對山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對抗AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)活性進行了評估，且探索了可能的作用機制。

1 材料

1.1 藥物和制劑 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷由實驗室自制，主要包括馬錢苷及莫諾苷等，經(jīng)HPLC測定分析總苷純度達到 67.4%;IL-6(批號:KGERC003-1)，IL-10(批號:KGERC004-2)，腫瘤壞死因子(TNF-α，批號:KGERC007-1)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1，批號:KGERC009-1)ELISA試劑盒購自北京科盈美科技有限公司;牛血清白蛋白，D-葡萄糖，氨基胍購自 Sigma公司;RAGE抗體購自 Sinio Biological Inc.;低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(FBS)，杭州四季青。

1.2 儀器 酶標儀(美國 Moleculor Devices，USA);LDZ4-1.2離心機(北京精力離心機有限公司);超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);164-5051型Western電泳儀(美國Bio-Rad公司);BL310型電子天平(德國Sartorias公司)，壓力蒸汽滅菌器(上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.3 細胞及動物 大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1，由武漢細胞生物研究所提供。SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，雄性，體質(zhì)量(18.0±2.0)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK-軍-2011-016。

2 方法

2.1 AGEs的制備 根據(jù)文獻的制備方法［7］，將5%牛血清白蛋白與0.5 mol/L的D-葡萄糖溶于0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液PBS(pH=7.2)中，混合液經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，置于無菌條件37℃ 孵育3個月。孵育完畢，將獲得的溶液以透析膜置于0.1 mol/L的PBS溶液中過夜除去未結(jié)合的分子，最后再用0.22μm濾膜過濾除菌，4℃下存儲備用。

2.2 細胞培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1細胞懸液接種至25 cm2的聚苯乙烯培養(yǎng)瓶中(GIBCO)，以低糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青/鏈霉素)培養(yǎng)。細胞保持在37℃條件95%空氣/5%CO2的培養(yǎng)箱中，待細胞長至80%～90%融合度時，以0.125%胰酶-0.1%EDTA消化，制備細胞懸液，作進一步實驗用。

2.3 巨噬細胞穿透能力測定 根據(jù)已有文獻的試驗方法［8］，將PBS溶液置于4℃冷藏2 h，待完全冷卻，取10 mL PBS注入昆明種小鼠腹腔，迅速脫臼處死，置于75%酒精中浸泡30 s，于超凈臺無菌環(huán)境中抽取腹液，置于10 mL離心管中，3000×g離心5 min，將沉淀物以0.83% 氯化銨吹勻，裂解紅細胞，3000×g離心5 min，將剩余的沉淀物以培養(yǎng)基吹勻，計數(shù)(1×105個/mL)，接種至24孔Transwell的上室，下室接種HBZY-1系膜細胞(5×105個/mL)，培養(yǎng)基應(yīng)高于上室膜的高度，保證巨噬細胞的孵育條件，然后共同孵育24 h。待孵育完畢，分別設(shè)牛血清白蛋白組(200μg/mL)、AGEs(200μg/mL)組、陽性對照氨基胍(10μmol/L)+AGEs(200μg/mL)、山茱萸環(huán)烯醚萜總苷高劑量(1 mg/mL)+AGEs(200μg/mL)、山茱萸環(huán)烯醚萜總苷中劑量(0.5 mg/mL)+AGEs(200μg/mL)和山茱萸環(huán)烯醚萜總苷低劑量(0.25 mg/mL)+AGEs(200μg/mL)。先給予藥物，間隔30 min后再給予AGEs。孵育24 h后，取出上室，以脫脂棉輕輕擦拭小室的內(nèi)側(cè)，PBS潤洗3次后，以1%結(jié)晶紫染色10 min，取出洗去未結(jié)合的結(jié)晶紫，然后以刀片取膜，以30%冰醋酸溶解，于580 nm波長下測定吸光度值。

2.4 炎癥因子的ELISA測定 在共培養(yǎng)結(jié)束后，將細胞的上清液取出，根據(jù)試劑盒的說明，測定細胞上清液中的炎癥因子 IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-α的分泌水平。在反應(yīng)完畢后，樣品于振蕩器中震蕩1 min以混勻，然后酶標儀中分別在450 nm條件下測定IL-6，IL-10，MCP-1和 TNF-α樣品的吸光度值。根據(jù)對照品標注曲線計算IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α的水平。

2.5 ICAM-1和 TGF-β1蛋白的 Western blot分析將1×106個/mL接種至6孔板中，給藥孵育后，以冰冷的PBS溶液潤洗3次，以細胞裂解液提取蛋白。勻漿轉(zhuǎn)移至 Ep管中，14000×g離心 15 min，取上清，以lowry法［6］測定上清液中的蛋白濃度。將定量好蛋白量的蛋白提取液(50μg)與蛋白電泳上樣緩沖液混合，煮5 min，然后上樣，以聚丙烯酰胺凝膠電泳10%SDS-PAGE進行分離(濃縮膠80 V恒壓30 min，分離膠100 V恒壓90 min)。完畢取出凝膠，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min。準備濾紙及NC膜，分別置入轉(zhuǎn)移緩沖液及去離子水中，進行濕電轉(zhuǎn)移(恒流200 mA通電，電轉(zhuǎn)移100 min)。NC膜在5%脫脂奶粉封閉液中4℃封閉過夜，棄去封閉液，不洗，依次加ICAM-1(1∶1000)和 TGF-β1(1∶1000)一抗、孵育、洗滌、HRP結(jié)合的二抗(1∶5000)、孵育2 h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。最后以ECL試劑盒按規(guī)定方法進行顯影曝光。圖像以Image-Pro plus(version 415，USA)處理并進行定量分析。β-actin作為內(nèi)參進行比較分析。

3 結(jié)果

3.1 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對巨噬細胞遷移能力的影響 從圖1可以看出，與牛血清白蛋白對照組相比，模型組細胞在給予AGEs刺激24 h后，紫色結(jié)晶明顯增多(P＜0.01)。在先給予陽性對照藥AGEs抑制劑氨基胍，再給予AGEs后，AGEs誘導(dǎo)遷移的巨噬細胞顯著減少(P＜0.01)。與AGEs模型組相比，在先給予各劑量組山茱萸環(huán)烯醚萜總苷(1.0、0.5、0.25 mg/mL)后，遷移巨噬細胞均明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。圖2的結(jié)果顯示AGEs組的吸光度值為0.29±0.02，而不同山茱萸環(huán)烯醚萜總苷給藥組(1.0、0.5、0.25 mg/mL)的吸光度值分別為 0.17±0.02(高)，0.22±0.03(中)，0.27±0.01(低)，相對的抑制率為42.09% ±7.25%，26.44%±10.23%，20.84% ±6.84%，說明山茱萸環(huán)烯醚萜總苷具有抑制AGEs誘導(dǎo)的巨噬細胞遷移的作用，并且該抑制作用呈劑量。

圖1 巨噬細胞遷移圖(結(jié)晶紫染色，200×)Fig.1 Macrophage migration(crystal violet staining，200×)

圖2 遷移的巨噬細胞吸光度值Fig.2 Absorbance value of migration of macrophages

3.2 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對炎癥因子IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α水平的影響 與空白對照200μg/mL牛血清白蛋白組相比，給予200μg/mL AGEs 24 h后，模型組炎癥因子IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α水平均有明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)。但是在給予不同劑量山茱萸環(huán)烯醚萜總苷(1.0、0.5 mg/mL)后，與模型組相比，高、中劑量給藥組均能劑量依賴性地降低 IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-α水平，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果表明，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷具有減輕AGEs-誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子的分泌水平，減緩系膜損傷。見表1。

表1 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對HBZY-1細胞IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α水平的影響(，n=6)Tab.1 Effect of iridoid glucosides from Corni officinalis Fructus on the levels of IL-6，IL-10，MCP-1 and TNF-α in HBZY-1 cells(，n=6)

表1 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對HBZY-1細胞IL-6，IL-10，MCP-1和TNF-α水平的影響(，n=6)Tab.1 Effect of iridoid glucosides from Corni officinalis Fructus on the levels of IL-6，IL-10，MCP-1 and TNF-α in HBZY-1 cells(，n=6)

注:與牛血清蛋白組相比，＊＊P＜0.01;與AGEs組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

組 別 IL-6/(ng·L－1) IL-10/(ng·L－1) MCP-1/(ng·L－1) TNF-α/(ng·L－1)1.47±0.17 0.86±0.14 0.44±0.07 1.25±0.17 AGEs組 1.73 ±0.21 ＊＊ 1.13 ±0.08＊＊ 0.69±0.05＊＊ 1.66±0.21＊＊陽性對照氨基胞+AGEs組 1.52±0.16## 0.92±0.12## 0.48±0.13## 1.29±0.25##山茱萸環(huán)烯醚萜總皂苷高劑量+AGEs組 1.49±0.09## 0.88±0.10## 0.48±0.04## 1.28±0.14##山茱萸環(huán)烯醚萜總皂苷中劑量+AGEs組 1.57±0.15# 0.95±0.07# 0.55±0.11# 1.40±0.22#山茱萸環(huán)烯醚萜總皂苷低劑量+AGEs組牛血清蛋白組1.62±0.09 1.06±0.13 0.60±0.09 1.57±0.31

3.3 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對促炎癥因子ICAM-1和TGF-β1蛋白表達的影響 Western blot分析結(jié)果顯示，與牛血清白蛋白組相比，在給予AGEs刺激后，促炎癥因子ICAM-1和TGF-β1的蛋白表達顯著增加(P＜0.01)。而先給予不同劑量山茱萸環(huán)烯醚萜總苷后，再給AGEs后，ICAM-1和TGF-β1的蛋白表達被劑量依賴性地下調(diào)(圖3)。與AGEs組相比，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05，P＜0.01)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，AGEs模型組ICAM-1的蛋白表達水平為1.54±0.14，而各劑量山茱萸環(huán)烯醚萜總皂苷組(1.0、0.5、0.25 mg/mL)的ICAM-1蛋白表達水平分別為0.66±0.03、1.01±0.12、1.28±0.08;對于 TGF-β1，AGEs模型組的蛋白水平為1.59±0.15，不同劑量山茱萸環(huán)烯醚萜總苷組的蛋白表達分別為0.73±0.07、0.77±0.11、1.32±0.14。Western blot分析結(jié)果表明山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能下調(diào)AGEs誘導(dǎo)的促炎癥因子的蛋白表達，降低炎癥反應(yīng)。

圖3 ICAM-1和 TGF-β1 的 western blot圖Fig.3 Western blot analysis of ICAM-1 and TGF-β1

對于可能的作用機制，以AGEs受體(RAGE)的特異性抗體來阻斷AGEs的損傷作用。圖3和表2的結(jié)果顯示，在先給予5μg/mL的RAGE抗體后，AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)被顯著抑制(P＜0.01)。這個結(jié)果提示AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)至少與RAGE的作用相關(guān)，且山茱萸環(huán)烯醚萜總苷減輕AGEs的炎癥反應(yīng)的作用與RAGE抗體的作用機制可能相似。

表2 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對 HBZY-1細胞 TGF-β1和ICAM-1蛋白表達的影響(，n=3)Tab.2 Effect of iridoid glucosides from Corni officinalis Fructus on TGF-β1 and ICAM-1 protein expressions(，n=6)

表2 山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對 HBZY-1細胞 TGF-β1和ICAM-1蛋白表達的影響(，n=3)Tab.2 Effect of iridoid glucosides from Corni officinalis Fructus on TGF-β1 and ICAM-1 protein expressions(，n=6)

注:與牛血清蛋白組相比，＊＊P＜0.01;與AGEs組相比，#P＜0.05;##P＜0.01

ICAM-1牛血清蛋白組組 別 TGF-β10.086±0.025 0.087±0.015 AGEs組 1.547±0.136＊＊ 1.590±0.151＊＊RAGE抗體+AGEs組 0.556±0.087## 0.601±0.045##山茱萸環(huán)烯醚萜總皂苷高劑量+AGEs組 0.662±0.030## 0.733±0.071##山茱萸環(huán)烯醚萜總皂苷中劑量+AGEs組 1.014±0.117## 0.753±0.116##山茱萸環(huán)烯醚萜總皂苷低劑量+AGEs組 1.284±0.080# 1.323±0.141#

4 討論

糖尿病腎病是一種常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，主要病理特征是基底膜增厚，導(dǎo)致腎小球硬化，當發(fā)展到晚期，腎組織被大量破壞，腎的排泄功能出現(xiàn)進行性衰退，體內(nèi)代謝產(chǎn)物及毒性物質(zhì)排泄減少，引起體內(nèi)環(huán)境的紊亂，臨床上出現(xiàn)一系列的慢性腎功能衰竭表現(xiàn)，即終末期腎病綜合征［9］。糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展與多種因素相關(guān)，如高血壓、高血糖、肥胖、遺傳等。其中，因高血糖引發(fā)的糖代謝紊亂是一個重要的因素。在生物機體內(nèi)，異常增多的還原糖與體內(nèi)的蛋白、核酸以及脂質(zhì)發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)，形成一類具有毒性的交聯(lián)產(chǎn)物，稱之為晚期糖基化終末產(chǎn)物，即AGEs［10］。異常增多積聚的AGEs與受體結(jié)合，觸發(fā)級聯(lián)信號事件，導(dǎo)致腎小球病理變化。

越來越多研究顯示，AGEs引發(fā)的炎癥對糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展起著不可忽略的作用。Hotamisligil研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病的炎癥是一種慢性低度、代謝引發(fā)的炎癥，主要由營養(yǎng)物和代謝過剩所觸發(fā)［11］。AGEs可以導(dǎo)致多種促炎癥因子和炎癥因子的表達增加，例如MCP-1、ICAM-1、白細胞介素系列、TGF-β1等。在本研究中發(fā)現(xiàn)腎系膜細胞暴露于AGEs能顯著增加炎癥因子的表達。這與以往的研究相一致。

山茱萸環(huán)烯醚萜苷是山茱萸中一類重要的活性成分，研究顯示其對糖尿病腎病具有顯著的保護作用。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能使系膜細胞的S期細胞減少，上調(diào)細胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性，下調(diào)ROS和 MDA［7，12］。許慧琴等研究還顯示山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能減少AGEs在腎皮質(zhì)的過度沉積，同時亦能顯著抑制RAGE的過高表達［13］。但是，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)還未見報道。在本實驗的細胞共培養(yǎng)體系中，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能顯著抑制巨噬細胞的遷移。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷抑制AGEs誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放，包括IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-α。除此之外，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷還下調(diào)AGEs誘導(dǎo)的促炎癥ICAM-1和TGF-β1的蛋白表達。在腎臟組織的病變中，AGEs上調(diào)的ICAM-1，可以促使單核巨噬細胞在腎臟組織中浸潤，釋放各種炎性因子如IL-6、IL-10、TGF-β1等，進一步促進炎細胞的浸潤［14］。對于炎癥因子MCP-1，是單核細胞最強的趨化因子。研究發(fā)現(xiàn)MCP-1在糖尿病腎病中呈現(xiàn)表達上調(diào)，可以調(diào)節(jié)黏附分子的表達，促使單核細胞浸潤腎組織［15］。

許多研究顯示AGEs和RAGE的相互作用在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［16］。AGEs與系膜細胞表面的RAGE結(jié)合并活化RAGE，觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致大量的活性氧和活性氮的生成。氧化應(yīng)激引發(fā)腎系膜細胞內(nèi)的促炎癥反應(yīng)，上調(diào)炎癥介質(zhì)的分泌，形成微炎癥環(huán)境，最終引起腎系膜細胞的結(jié)構(gòu)和功能的紊亂。在本研究中，以RAGE的特異性抗體阻斷AGEs與RAGE的相互作用來探索山茱萸環(huán)烯醚萜總苷可能的作用機制。結(jié)果證明RAGE抗體能部分減輕AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而山茱萸環(huán)烯醚萜總苷具有類似的作用。這可能與山茱萸環(huán)烯醚萜總苷干預(yù)AGEs-RAGE的相互作用有關(guān)。但是山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對抗AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是否是通過此受體作用，仍需進一步的深入研究。

總之，本研究顯示山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能減輕AGEs誘導(dǎo)的腎系膜細胞的炎癥反應(yīng)，對糖尿病腎病具有較好的干預(yù)作用。這種作用可能是與干預(yù)AGEs-RAGE途徑相關(guān)。

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