廖信軍，李雅宜，胡雪華

匍匐莖草本蛇莓RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化

*廖信軍，李雅宜，胡雪華

（井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安 343009）

為了建立蛇莓RAPD反應(yīng)的最佳反應(yīng)體系，我們對(duì)每個(gè)反應(yīng)因子進(jìn)行優(yōu)化研究。在本實(shí)驗(yàn)室常用的RAPD反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，根據(jù)RAPD擴(kuò)增效果確定蛇莓基因組DNA的最佳RAPD反應(yīng)體系。經(jīng)優(yōu)化后，我們建立了適合蛇莓的最佳RAPD反應(yīng)體系：25 μL反應(yīng)體系中含10×Buffer 2.5 μL，2 mmol/L Mg2+，1.5 UTaqDNA聚合酶，50 ng模板，0.22 mmol/L dNTPs，0.35 μmol/L隨機(jī)引物S30。本研究結(jié)果為下一步野生蛇莓遺傳多樣評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

蛇莓；RAPD；擴(kuò)增程序

蛇莓()為薔薇科多年生草本植物，其性味甘、苦、寒，具有清熱涼血、消腫解毒之功效，臨床上應(yīng)用于治療熱病、驚癇、咽喉腫痛、咳嗽吐血、蛇蟲咬傷等[1-3]。目前，蛇莓中化學(xué)成分分析研究較多[4-6]，而有關(guān)蛇莓分子遺傳標(biāo)記研究鮮有報(bào)道，僅姚旭麗等人2009年進(jìn)行了蛇莓ISSR-PCR體系的建立和優(yōu)化的研究[7]。RAPD由Williams和We1sh兩個(gè)研究小組兒乎同時(shí)于1990年建立起來(lái)的一項(xiàng)分子標(biāo)記技術(shù)，是目前中藥研究者最常使用的DNA標(biāo)記技術(shù)[8-9]。但RAPD易受各種因素的干擾，其最佳擴(kuò)增條件在不同物種各有不同，因此，在對(duì)不同物種進(jìn)行RAPD分析時(shí)，完全有必要對(duì)各因子的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立穩(wěn)定的、最佳的反應(yīng)體系。本研究將對(duì)蛇莓RAPD體系進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步評(píng)估野生蛇莓群體遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為野生蛇莓群體，采自吉安市井岡山大學(xué)校園內(nèi)。每個(gè)植株上摘取莖尖端的少量幼葉，編號(hào)然后置于保鮮袋中，密封保存，放到冰壺內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室后洗凈晾干，并于當(dāng)日提取基因組DNA。

1.2 基因組DNA提取

參考改良CTAB法[10]提取基因組DNA。

1.3 DNA濃度及純度檢測(cè)

提取的DNA先進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后經(jīng)紫外分光光度計(jì)（Eppendorf）檢測(cè)其濃度和純度，最后用ddH2O稀釋至25 ng/μL。

1.4 試劑

試驗(yàn)所用MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶均購(gòu)自上海生工，隨機(jī)引物由上海生工合成。

1.5 RAPD反應(yīng)

以蛇莓基因組DNA為模板，對(duì)已篩選的S30（5’－3’依次為GTGATCGCAG）隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增（德國(guó)Biometra-T3000ThermocyclerPCR儀）。本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響擴(kuò)增結(jié)果的模板濃度、鎂離子濃度、Taq酶、引物濃度、dNTPs濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等主要因子進(jìn)行依次研究。在保持其他因子不變的情況下，按一定梯度改變單一因子進(jìn)行擴(kuò)增，篩選最優(yōu)條件，以獲得最優(yōu)化、最穩(wěn)定的反應(yīng)體系（各因子梯度見(jiàn)表1）。

1.6 RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

RAPD產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（含Goldview）電泳（10 V/cm，35 min）分離，DNA Ladder范圍為100~3000 bp，YLN-2000凝膠成像儀觀察照相。

表1 RAPD反應(yīng)體系各成分優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

注：反應(yīng)總體積25μL（含10×buffer 2.5μL）

2 結(jié)果與分析

2.1 模板DNA

基本反應(yīng)體系：2.5 μL 10*Buffer，2 μL 1.8 mmol/L MgCl2，0.5 μL 2.0 U TaqDNA聚合酶，2.5 μL dNTP，0.4 μL primer，dd H2O 補(bǔ)充至25 μL。 DNA優(yōu)化分5個(gè)濃度梯度進(jìn)行：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ng/μL。結(jié)果見(jiàn)圖1：模板DNA用量在0.5~2.5 ng/μL的范圍內(nèi)均能擴(kuò)增出條帶，當(dāng)濃度為0.5 ng/μL時(shí)條帶稍淡，濃度為2 ng/μL時(shí)條帶最清晰。因此，我們最后選取了濃度為2.0 ng/μL (總含量50 ng)為最佳模板濃度。

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2.2 引物

引物濃度低時(shí)，無(wú)法與所有的模板DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果不理想；引物濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)增加堿基錯(cuò)配的機(jī)率，產(chǎn)生非特異性條帶。本研究，基本反應(yīng)體系：2.5 μL 10*Buffer，2 μL1.8 mmol/L MgCl2，0.5 μL 2.0 U TaqDNA聚合酶，2.5 μL dNTP，50 ng DNA，dd H2O 補(bǔ)充至25 μL，引物設(shè)計(jì)了5個(gè)梯度（依次為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 μmol/L）。結(jié)果見(jiàn)圖3：引物濃度小于0.2 μmol/L時(shí)條帶淡且數(shù)目明顯更少，引物濃度在0.4~0.5 μmol/L較其它濃度更清晰，出于節(jié)約成本最終確定的引物采用量為0.4 μmol/L。

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2.3 dNTP

dNTPs是反應(yīng)中磷酸根的主要來(lái)源，其濃度大小直接影響產(chǎn)物的質(zhì)量，特異性及合成的可靠性[11]。本研究基本反應(yīng)體系：2.5 μL 10*Buffer， 2 μL 1.8 mmol/LMgCl2，0.5 μL 2.0 U TaqDNA聚合酶，50 ng DNA，0.4 μL primer，dd H2O 補(bǔ)充至25μL，dNTP在120~240 μmol/L之間，設(shè)置了5個(gè)濃度梯度，分別為120，160，200，220，240 μmol/L。結(jié)果見(jiàn)圖2。

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注：條帶從強(qiáng)到弱的濃度依次為，220，200，160，240，120μmol/L。故，選擇dNTP終濃度為220 μmol/L進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。

2.4 Mg2+濃度

Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，濃度過(guò)高會(huì)使反應(yīng)特異性降低，濃度過(guò)低又會(huì)降低Taq酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少[12]。本研究基本反應(yīng)體系：2.5 μL 10*Buffer，2.2 μL dNTP，0.5 μL 2.0U TaqDNA聚合酶，50ng DNA，0.4 μL primer，dd H2O 補(bǔ)充至25 μL，Mg2+濃度設(shè)置了5個(gè)濃度梯度（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L）。結(jié)果見(jiàn)圖4：當(dāng)Mg2+濃度當(dāng)Mg2+濃度為1.0 mmol/L時(shí)，未見(jiàn)條帶；1.5~3.0 mmo1/L之間均能擴(kuò)增出較亮、較好的條帶，在2.5 mmo1/L濃度時(shí)條帶最清晰。綜合考慮，本試驗(yàn)Mg2+最適宜濃度為2.5 mmol/L。

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2.5 Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是擴(kuò)增反應(yīng)的關(guān)鍵因素，基本反應(yīng)體系：2.5 μL 10*Buffer, 2.2 μL dNTP, 2.5 μL 1.8 mmol/LMgCl2, 50 ng DNA, 0.4 μL primer, dd H2O 補(bǔ)充至25 μL，T aq DNA聚合酶濃度從高到低共設(shè)置5個(gè)梯度:0.010，0.020，0.040，0.060，0.070 U/μL即總酶量為5個(gè)梯度:0.25，0.50，1.00，1.50，1.75 U。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5)：Taq DNA聚合酶具有很高的活性，即使在低濃度下(0.25 U)也有擴(kuò)增結(jié)果，只是條帶稍少且不穩(wěn)定；在高濃度(1.75 U)下帶型豐富，出現(xiàn)模糊現(xiàn)象，而且非特異性產(chǎn)物增多；1.50 U擴(kuò)增出的條帶多且清晰，故1.5 UTaqDNA聚合酶量最合適。

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2.6 反應(yīng)程序?qū)APD擴(kuò)增的影響

圖6顯示，第1~9泳道都出現(xiàn)了條帶，但條帶不多且亮度比較弱，背景比較模糊，第10~12和第16~18泳道背景適宜，但部分條帶比較弱且亮度不夠，相比之下13~15泳道的條帶多且清晰，這3個(gè)泳道中15泳道的條帶最多且背景最清晰、亮度適宜。綜合考慮，第15泳道的反應(yīng)程序?yàn)樽罴训姆磻?yīng)程序。即預(yù)擴(kuò)增時(shí)退火溫度為36 ℃；擴(kuò)增時(shí)退火溫度為40 ℃，延伸時(shí)間為60 s。

圖6 反應(yīng)程序?qū)U(kuò)增的影響

注: 1~9延伸時(shí)間75 s，10~18延伸時(shí)間60 s，1~3和10~12預(yù)擴(kuò)增時(shí)退火溫度為34 ℃，4~6和13~15預(yù)擴(kuò)增時(shí)退火溫度為36 ℃，7~9和16~18預(yù)擴(kuò)增時(shí)退火溫度為38 ℃，1、4、7、10、13、16擴(kuò)增時(shí)退火溫度為36 ℃，2、5、8、11、14、17擴(kuò)增時(shí)退火溫度為38 ℃，3、6、9、12、15、18擴(kuò)增時(shí)退火溫度為40 ℃。M: SM0321 Marker

2.7 優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性

采用優(yōu)化后的RAPD擴(kuò)增體系對(duì)不同株個(gè)體DNA進(jìn)行進(jìn)行擴(kuò)增，圖7的擴(kuò)增結(jié)果表明，該體系在這11株個(gè)體材料中均能擴(kuò)增出清晰的帶型，擴(kuò)增出的條帶較亮，條帶數(shù)量適宜，且主帶清晰，其中8號(hào)為用于RAPD條件優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)樣品。

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3 討論

RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，一直是受人們關(guān)注，這種隨機(jī)擴(kuò)增容易受到其反應(yīng)體系中各成分含量的影響，所以在進(jìn)行RAPD分析之前，完全有必要對(duì)各因子的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化[13]。模板DNA濃度的輕微變化不影響擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型，但擴(kuò)增的強(qiáng)度略有不同，總體來(lái)說(shuō)DNA濃度可允許在一定范圍內(nèi)變動(dòng)[14]。本文發(fā)現(xiàn)蛇莓的模板DNA用量在12.5~62.5 ng的范圍內(nèi)均能獲得擴(kuò)增條帶，用量在50 ng時(shí)為最佳；隨機(jī)引物與模板DNA的量之間有一種協(xié)同作用，當(dāng)隨機(jī)引物達(dá)到一定的濃度時(shí)，出現(xiàn)隨機(jī)引物爭(zhēng)奪模板DNA的情況，因此必須選擇合適的引物濃度。本試驗(yàn)設(shè)定的引物濃度的范圍相對(duì)于范惠玲等人[15]所設(shè)定的篩選范圍更小，確定最佳引物濃度為0.4 μmol/L；Mg2+與dNTPs的比例應(yīng)適當(dāng)，否則會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈化或擴(kuò)增產(chǎn)物減少導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。張秀英等[16]得出Mg2+較小變動(dòng)可導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物較大差異，因此確定Mg2+的濃度也是很關(guān)鍵的；Taq聚合酶在實(shí)驗(yàn)期間不可隨意更換，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的酶得出的條帶數(shù)量和大小均有差異，嚴(yán)奉坤等人（2007）也得出類似結(jié)論[17]。

[1] 叔慎.益壽野果蛇莓[J].中國(guó)土特產(chǎn),1999(1):10-15.

[2] 薛紅衛(wèi).蛇莓藥理與臨床研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2002,9(9):79-80.

[3] 吳英俊,王超男,劉潔婷,等. 蛇莓中齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721 的抑制作用[J]. 中國(guó)生化藥物雜志,2011,32(4):306-308.

[4] 段軻偉. 蛇莓中化學(xué)成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2012.

[5] 趙萍. 薔薇科植物蛇莓活性成分的化學(xué)研究[D].延邊：延邊大學(xué)，2011.

[6] 董國(guó)超. 蛇莓活性成分的分離及研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2011.

[7] 姚旭麗,李鈞敏,謝亞琴,等. 蛇莓ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(2):55-56.

[8] Williams J G, Kubelik A R, Livak K J, et a.l DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are usefμLasgeneticmakers [J].Nucleic AcidsRes, 1990, 25(18): 6531.

[9] Welsh J, Mcclell. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic-AcidsRes, 1990, 25(18): 7213.

[10] 陳昆松,李方,徐昌杰，等. 改良CTAB法用于多年生植物組織基因組DNA的大量提取[J].遺傳,2004,26(4): 529-531.

[11] 李瑞環(huán),李新崗,黃建,等.棗樹(shù)基因組DNA提取及其RAPD體系優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007,35(17):5102-5104.5148.

[12] 陳永勝,郝衛(wèi)國(guó),朱國(guó)立,等.蓖麻RAPD- PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化[J].農(nóng)藝科學(xué),2008,24(3):172-180.

[13] 王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,1998:100-106.

[14] 王麗,喬愛(ài)民,孫一銘,等. 菜心基因組DNA提取及RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 2006, 31(2):124-132.

[15] 范惠玲,孫萬(wàn)倉(cāng),孟業(yè)雄.蕓芥(Eruca. sativa Mill)總DNA提取方法及RAPD擴(kuò)增體系研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007,16(2):18-25.

[16] 張秀英,范亞文.蹄蓋蕨科DNA的提取和幾種因素對(duì)RAPD分析的影響[J].植物研究,2004,24(3):333-340.

[17] 嚴(yán)奉坤,許興,殷敏,等. 枸杞RAPD反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2007, 18(8):1819-1821.

OPTIMIZATION OF RAPD REACTION SYSTEM IN THE STOLONIFEROUS HERB,

*LIAO Xin-jun, LI Ya-yi, HU Xue-hua

(School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

In order to establish the optimal RAPD reaction system in, every factor in the system was optimized. Based on the RAPD reaction system commonly used in our lab, the optimal RAPD reaction system of genome DNA ofwas determined according to the RAPD amplification effects. The optimal PCR system was as follows: 2.5 μL 10×buffer, 2.0 mmol/L Mg2+, 1.5 U Taq polymerase, 50 ng DNA template, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.35 μmol/L random primer S30 in 25μl reaction system. The results of this paper will lay the basis for assessing the genetic diversity of the wild.

; RAPD; amplification procedure

Q785/Q948.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.04.008

1674-8085(2013)04-0037-04

2013-03-01；

2013-06-17

井岡山大學(xué)科研項(xiàng)目(JZ0821)

*廖信軍(1978-），男，江西吉安人，實(shí)驗(yàn)師，博士生，從事分子遺傳學(xué)研究和教學(xué)(E-mail：liaoxinjun7811@126.com);

李雅宜(1987-），男，福建龍巖人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail：liyayi56@126.com);

胡雪華(1977-），女，江西吉安人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事植物學(xué)研究(E-mail：huxuehua2008@jgsu.edu.cn ).