尼砸木·艾海提，買熱艷木·艾爾肯，祖麗比亞·司馬義，依米提·熱合曼

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046

蜂膠具有抗氧化、抗菌、等多種藥理活性，在民間醫(yī)療中具有悠久的歷史。蜂膠基本成分是樹脂(類黃酮和相關(guān)的酚酸)、蠟、揮發(fā)油、花粉［1］，目前蜂膠中鑒定出的化合物中黃酮類化合物71種，芳香酸及其酯59種，咖啡酸酯類化合物近10種［2］。日本研究者Yoshimi Nakajima對巴西蜂膠水提物，醇提物及花粉的抗氧化活性進(jìn)行比較研究中發(fā)現(xiàn)巴西蜂膠醇提物表現(xiàn)較強(qiáng)羥基和超氧陰離子自由基清除化活性［3］。

新疆具有豐富的蜂膠資源，蜂膠的生物學(xué)活性受生態(tài)系統(tǒng)和氣候條件的影響，由于新疆區(qū)內(nèi)各地生態(tài)環(huán)境差異較大，在新疆不同區(qū)域產(chǎn)蜂膠成分也必然存在一定的差異同時具有相似的一些生物學(xué)活性，在這科研領(lǐng)域內(nèi)有關(guān)基于新疆產(chǎn)蜂膠進(jìn)行研究的報(bào)道很少，因此我們使用新疆伊犁那拉提，尼勒克縣產(chǎn)蜂膠抗氧化活性進(jìn)行研究為蜂膠研究開發(fā)提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蜂膠取自新疆伊犁那拉提、尼勒克縣蜂場(采集時間為2011年秋季)。槲皮素、蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號080-9705);二苯代苦味酰自由基(DPPH，Sigma產(chǎn)品);無水乙醇、5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、5%氫氧化鈉、焦性沒食子酸(鄰苯三酚)、Tris-鹽酸、鹽酸等試劑均為市售國產(chǎn)分析純;水為純化水。離心機(jī)(上海安亭醫(yī)用儀器廠);UV-3600型紫外線分光光度計(jì)(UV-2100型，上海分析儀器廠);電子天平(JA1203型，上海天平儀器廠);GKC型水浴鍋;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量的測定

1.2.1.1 蜂膠醇提物的制備

將原料蜂膠加入冰箱冷凍5 h(蜂膠在15℃以下變硬變脆，在此溫度以上具有粘性，不便粉碎)，粉碎取2 g粉碎的蜂膠，按料液比10∶1用濃度為95%的乙醇，浸提34 h，提取溫度34℃，離心分離取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得浸膏，在烘箱中烘至恒重。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，置100 mL容量瓶中加入乙醇溶液定容，即得0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 分別置于 25 mL 容量瓶中，各加乙醇6 mL，5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖均，放置10 min;加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖均，放置10 min;加5%氫氧化鈉溶液10 mL，搖均，加乙醇定容，放置15 min;以鋪料溶液作為空白，同蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線一樣配置樣品溶液，取1 mL置于25 mL容量瓶中加乙醇6 mL，空白對照直接加乙醇至25 mL容量瓶中，其余操作同蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法。蘆丁對照品乙醇溶液及蜂膠提取液用NaNO2、A1(NO)3、NaOH顯色后，于200～700 nm間掃描，在500 nm處有均最大吸收，因此選擇500 nm為測定波長［4，6］。

總黃酮含量計(jì)算公式:

式中:S:總黃酮含量%;C:通過標(biāo)準(zhǔn)曲線差的總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);M:蜂膠用量(g)。

1.2.2 抗氧化活性測定

1.2.2.1 蜂膠醇提物超氧陰離子自由基清除率測定

取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)1.4 mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入試樣1 mL和2 mmol/L聯(lián)苯三酚溶液0.1 mL，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mol/L HCl 0.5mL終止反應(yīng)，325 nm處測定光密度D(λ)i對照組以相同體積的蒸餾水代替樣品。每個試樣作5次平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值。清除率計(jì)算公式為［7］

式中:D(λ)o為空白對照的光密度;D(λ)i為試樣的光密度。

1.2.2.2 蜂膠醇提物DPPH清除率測定

取2 mL不同濃度的蜂膠醇提物液液于試管中，加入2 mL DPPH溶液(無水醇配制)，混合均勻，反應(yīng)30 min后在518 nm測定其吸光度Ai，以2 mL水代替樣品Ac，以2 mL樣品與2 mL無水乙醇混合液為Aj，以消除樣品本身的影響，以2 mL水與2 mL無水乙醇的混合液調(diào)零點(diǎn)［8］。

式中:Ai=2 mL DPPH溶液+2 mL待測溶液吸光度值;Aj=2 mL待測溶液+2 mL溶劑的吸光度值;Ac=2 mL DPPH溶液+2 mL溶劑的吸光度值。

1.2.2.3 蜂膠醇提物羥基自由基清除率

取0.2 mL的FeSO4-EDTA(10 mmol/L)混合液于具塞試管中，加入0.2 mL的2-脫氧-D-核糖溶液(10 mmol/L)，然后再加入一定量的樣品溶液，并用磷酸緩沖液(pH 7.4)定容到1.8 mL，最后加入0.2 mL的H2O2(10 mmol/L)，混勻后于37℃保溫1 h，再加入2.8%三氯乙酸1.00 mL，1.0%硫代巴比妥酸溶液1 mL，混勻后，沸水浴煮沸10 min，冷水冷卻。不加DR的反應(yīng)混合液不發(fā)生反應(yīng)，作為比色時的空白液，測 A532，計(jì)算清除率 P［9］。

式中:As:加樣品液并在37℃水浴中反應(yīng)的吸光值;Ac:不加樣品液，同上操作的吸光值;Ao:不加樣品液并且不在37℃水浴中反應(yīng)的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

為了檢驗(yàn)不同濃度梯度樣品抗氧化活性與陽性對照間有無顯著差異，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用單因素方差分析的方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn):α =0.05;測定樣品的半清除率使用單因素線性回歸分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蜂膠黃酮含量

伊犁那拉提縣和尼勒克縣蜂膠經(jīng)過95%乙醇提取后提取率分別為40%、34%。以質(zhì)量濃度對吸光度作圖，線性回歸得蘆丁質(zhì)量濃度(x)和吸光度(y)的回歸方程為 y=9．8223x-0．003(R2=0.9998)。伊犁那拉提縣和尼勒克縣蜂膠總黃酮含量分別為9.015±0.203%、7.710±0.259%，總黃酮含量無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 蜂膠醇提物超氧自由基清除作用

槲皮素作為陽性對照，使用濃度為100、80、40、20、10 μg/mL的蜂膠醇提物測定對超氧陰離子自由基的清除能力，結(jié)果表1顯示，隨著那拉提、尼勒克蜂膠醇提物濃度升高對超氧陰離子自由基清除活性也增加，當(dāng)濃度為100 μg/mL時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對超氧陰離子自由基清除活性與槲皮素進(jìn)行比較，沒有顯著差異(P ＞0.05)，濃度為80、40、20、10 μg/mL時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對超氧陰離子自由基的清除能力顯著低于槲皮(P ＜0.01)。那拉提蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=1.355X-21．27，R2=0.9584，IC50=46.48 μg/mL;尼勒克蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=1．3152X-18．568，R2=0.9477，IC50=47.19 μg/mL;槲皮素回歸曲線方程:Y=1．7769X-67．585，R2=0.9591，IC50=21.26 μg/mL(X:清除率;Y:樣品濃度)。

表1 那拉提、尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性(n=5，±s)Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

表1 那拉提、尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性(n=5，±s)Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

注:與槲皮素比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with quercetin，*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01.

樣品濃度Sample concentration(μg/mL)那拉提蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati(%)尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nileke(%)槲皮素超氧陰離子清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of quercetin(%)100 87.66±3.50 89.33±2.41 92.36±1.46 80 70.50±1.96＊＊ 68.73±2.31＊＊ 81.80±1.28 40 53.10±1.55＊＊ 51.16±1.47＊＊ 62.63±1.20 20 34.6±1.08＊＊ 36.53±1.90＊＊ 55.66±1.45 10 17.13±1.29＊＊ 14.93±2.23＊＊38.43±0.97

2.3 蜂膠醇提物DPPH清除作用

表2顯示隨著那拉提、尼勒克蜂膠醇提物濃度升高對DPPH自由基清除作用也呈顯增加趨勢，當(dāng)濃度為40 μg/mL時那拉提蜂膠醇提物對DPPH自由基清除作用與槲皮素進(jìn)行比較，沒有顯著差異(P＞ 0.05);濃度為 20、10、8、5 μg/mL 時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對DPPH自由基清除作用清除能力顯著低于槲皮素(P＜0.01)。那拉提蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=0．7422X-17．724，R2=0.8951，IC50=18.37 μg/mL;尼勒克蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=0．8323X-21．494，R2=0.9054，IC50=20.12 μg/mL;槲皮素回歸曲線方程:Y=1．0274X-41．41，R2=0.9141，IC50=9.95 μg/mL(X:清除率;Y:樣品濃度)。

表2 那拉提和尼勒克蜂膠醇提物DPPH自由基的清除活性(n=5，±s)Table 2 DPPH radical-scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

表2 那拉提和尼勒克蜂膠醇提物DPPH自由基的清除活性(n=5，±s)Table 2 DPPH radical-scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

樣品濃度Sample concentration(μg/mL)那拉提蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati(%)尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nileke(%)槲皮素超氧陰離子清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of quercetin(%)74.67±1.10 40 71.67±1.15 68.9±1.85*

注:與槲皮素比較，P ＜0.05，P ＜0.01。Note:Compared with quercetin，*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01.

2.4 蜂膠醇提物羥基自由基清除作用

表3顯示，槲皮素作為陽性對照使用濃度為100、80、40、20、10 μg/mL 的蜂膠醇提物測定其對羥基自由基的清除能力。隨著那拉提、尼勒克蜂膠醇提物濃度升高對羥基自由基清除活性也呈顯增加趨勢。當(dāng)濃度為100、80 μg/mL時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對羥基自由基清除作用與槲皮素進(jìn)行比較，沒有顯著差異(P ＞ 0.05);濃度為40、20、10 μg/mL時那拉提、尼勒克蜂膠醇提物對羥基自由基的清除能力顯著低于槲皮素(P＜0.01)。那拉提蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=1.0819X-16.55，R2=0.8912，IC50=37.54 μg/mL;尼勒克蜂膠醇提物回歸曲線方程:Y=1.1327X-20.746，R2=0.9163，IC50=36.24 μg/mL;槲皮素回歸曲線方程:Y=1.2817X-36.167，R2=0.9221，IC50=28.18 μg/mL(X:清除率;Y:樣品濃度)。

表3 那拉提和尼勒克蜂膠醇提物羥基自由基的清除活性(n=5，±s)Table 3 Hydroxyl radicals-scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

表3 那拉提和尼勒克蜂膠醇提物羥基自由基的清除活性(n=5，±s)Table 3 Hydroxyl radicals-scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati and Nileke(n=5，±s)

注:與槲皮素比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with quercetin，*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01.

樣品濃度Sample concentration(μg/mL)那拉提蜂膠醇提物超氧陰離子自由基的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nalati(%)尼勒克蜂膠醇提物超氧陰離子的清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of propolis alcohol extract of Nileke(%)槲皮素超氧陰離子清除活性Superoxide anion radical scavenging activity of quercetin(%)100 93.53±2.67 94.3±1.60 96.17±1.21 80 91.16±1.70 90.46±1.52 93.03±0.90 40 69.67±1.60＊＊ 68.50±1.15＊＊ 71.10±1.17 20 35.50±1.21＊＊ 37.20±1.05＊＊ 44.03±0.58 10 17.69±1.13＊＊ 20.73±0.78＊＊31.10±0.70

3 討論

蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，其中主要的功效成分為黃酮類化合物。新疆那拉提、尼勒克縣產(chǎn)蜂膠總黃酮含量分別為9.015±0.203%、7.710±0.259%，總黃酮含量無顯著差異(P ＞0.05)，其醇提物對DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除作用。本實(shí)驗(yàn)槲皮素作為陽性對照評價那拉提、尼勒克縣產(chǎn)蜂膠醇提物的抗氧化活性;那拉提、尼勒克縣產(chǎn)蜂膠醇提物濃度100 μg/mL時對超氧陰離子自由基清除活性與槲皮素比較沒有顯著差異(P＞0.05);那拉提、尼勒克縣產(chǎn)蜂膠醇提物IC50為46.48 μg/mL、47.19 μg/mL，槲皮素 IC50為 21.26 μg/mL;當(dāng)那拉提、尼勒克縣產(chǎn)蜂膠醇提物濃度為100、80 μg/mL羥基自由基的清除活性與槲皮素比較，沒有顯著差異(P ＞0.05);那拉提、尼勒克縣產(chǎn)蜂膠醇提物 IC50為37.54、36.24 μg/mL，槲皮素 IC50為28.18 μg/mL;濃度為40 μg/mL 時那拉提蜂膠醇提物對DPPH自由基清除活性與槲皮素進(jìn)行比較，沒有顯著差異(P ＞0.05)，那拉提、尼勒克縣產(chǎn)蜂膠醇提物 IC50為18.37、20.12 μg/mL，槲皮素 IC50為9.95 μg/mL。蜂膠的生物學(xué)、藥理學(xué)及醫(yī)療功效主要與蜂膠中所含的黃酮成分有關(guān)。研究表明，黃酮類化合物不僅可以清除機(jī)體內(nèi)外的自由基，同時對自由基和脂質(zhì)過氧化引起的多種疾病有治療作用，蜂膠作為一種天然抗氧化劑和活性氧清除劑，能防止機(jī)體各種疾病的引發(fā)良好天然產(chǎn)物。

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