許小鳳，李尚真，宋啟示*

1中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，昆明 650223;2中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049

血竭作為一種名貴中藥，其藥理作用已經(jīng)得到系統(tǒng)研究，并被證實(shí)具有活血和止血的雙重功效，另外，它還具有抗菌、抗毒、抗氧化、抗腫瘤等作用［1］。20世紀(jì)70年代以前，我國(guó)所用血竭均為國(guó)外進(jìn)口，直至1972年植物學(xué)家蔡希陶在云南孟連縣首次發(fā)現(xiàn)能夠提制血竭的劍葉龍血樹(shù)［Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen］后，國(guó)產(chǎn)血竭的生產(chǎn)和應(yīng)用才真正開(kāi)始［2］。2004年又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)海南龍血樹(shù)(D．cambodiana Pierre ex Gagnep)可以作為血竭的另一基源植物［3］。血竭形成主要原因是物理?yè)p傷和真菌誘導(dǎo)，然而由龍血樹(shù)自然損傷形成血竭，其過(guò)程十分緩慢，需要十幾年甚至幾十年。目前自然形成的血竭產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足急劇上升的市場(chǎng)需求，因此人工誘導(dǎo)血竭生產(chǎn)已成為當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者江東福、王興紅等［4，5］將從龍血樹(shù)莖桿上分離得到的鐮刀菌屬菌株回接于龍血樹(shù)枝條內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些菌株對(duì)于血竭的形成具有良好的誘導(dǎo)作用，這表明鐮刀菌屬真菌和血竭的形成有一定的關(guān)系。本研究采用代號(hào)為brwg鐮刀菌屬真菌為誘導(dǎo)因子，以不同的處理方式將真菌回接于海南龍血樹(shù)的活體莖干部位，以龍血素A和龍血素B作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，探討不同處理方法對(duì)血竭產(chǎn)量的影響，從而為人工接菌誘導(dǎo)血竭生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 儀器與材料

1.1 供試材料

海南龍血樹(shù)是位于云南省勐侖鎮(zhèn)中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園綜合實(shí)驗(yàn)樓旁;所用真菌是2002年從劍葉龍血樹(shù)莖桿帶紅色脂塊損傷部位分離得到的一株真菌(代號(hào)brwg)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定為鐮刀菌屬真菌Fusarium graminearum，菌種保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;血竭藥品為雨林牌龍血竭膠囊，國(guó)藥準(zhǔn)字Z53021514，購(gòu)于西雙版納雨林制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)051101;高氮培養(yǎng)基(酵母膏0.1 g，蔗糖2 g，蛋白胨5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL);高碳培養(yǎng)基(酵母膏0.1 g，蔗糖10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL);PDA培養(yǎng)基(土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

龍血素A對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室前期分離得到)，龍血素B對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，甲醇、乙腈均為色譜純，冰乙酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

98-1-B型加熱提取器、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)、GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、HZQF160型全溫振蕩培養(yǎng)箱、BüCHI R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Waters高效液相色譜儀、AL104型電子天平、HS10260D型超聲波震蕩儀、電鉆、80-2型離心沉淀機(jī)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 真菌代謝產(chǎn)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

配制高碳、高氮、PDA平板培養(yǎng)基三組，高溫滅菌后均接入brwg真菌，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。觀察記錄真菌生長(zhǎng)狀況。再將生長(zhǎng)有真菌的平板培養(yǎng)基分別置于16、28、35℃的環(huán)境下培養(yǎng)7 d。取出培養(yǎng)完全的真菌，冷凍干燥24 h，并磨成粉末，用甲醇超聲提取，并濃縮得到真菌代謝產(chǎn)物。用HPLC方法檢測(cè)其成分。

2.2 菌株回接實(shí)驗(yàn)

選取自然條件下生長(zhǎng)的海南龍血樹(shù)直徑約3 cm的生長(zhǎng)健康的枝條，用電鉆鉆孔，孔徑1.2 cm，孔深為枝條直徑的2/3。做不同處理，處理①:只鉆孔不接菌，不扎傷口，讓傷口裸露于空氣中;處理②:用滴管將菌懸液(菌株搖床培養(yǎng)所得)滴入孔中，不扎傷口，使其接菌部位自然裸露;處理③:用滴管將菌懸液滴入孔中，并用塑料帶扎緊傷口，盡量不讓傷口接觸空氣。以不做任何處理的枝條作為空白對(duì)照0。處理過(guò)的枝條自然生長(zhǎng)4年后采集樣品進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。每種處理做5個(gè)重復(fù)。

2.3 樣品預(yù)處理

經(jīng)①、②、③處理過(guò)的枝條鉆孔部位均呈現(xiàn)了不同程度的紅色，將這些含紅色物質(zhì)的莖段鋸下并晾干磨成粉末。用甲醇加熱至沸騰回流提取，每批樣品共提取兩次，提取過(guò)程:加熱12 h后，冷卻，靜置12 h，取上層甲醇相。將得到的甲醇溶液濃縮蒸干，得到紅色粉末，即為待測(cè)樣品。取空白對(duì)照枝條作同樣預(yù)處理。

2.4 HPLC檢測(cè)方法

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取龍血素A 2 mg和龍血素B 1 mg，加入色譜甲醇，超聲溶解30 min后定容至10 mL，將配置成的溶液稀釋10倍，即得到0.02 mg/mL的龍血素A溶液和0.01 mg/mL的龍血素B溶液。

2.4.2 待測(cè)樣品溶液配制

分別精確稱(chēng)取各批次樣品100 mg，加入色譜甲醇溶解，超聲30 min，定容至10 mL，離心 10 min，經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾，即得待測(cè)樣品溶液。

2.4.3 血竭藥品溶液配制

稱(chēng)取血竭藥品100 mg，加色譜甲醇溶解，超聲30 min 定容至10 mL，離心10 min，用0.45 μm 的濾膜過(guò)濾即得血竭藥品溶液，作為指紋圖譜的參照品溶液。

2.4.4 色譜條件

使用Waters 1525高效液相色譜系統(tǒng)，裝備Waters Symmetry C18柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)和Waters 2487紫外檢測(cè)器;設(shè)定柱溫為40℃，流動(dòng)相:冰醋酸溶液(水∶醋酸 =100∶1)∶乙腈 =63∶37，流速為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按龍血素A、B峰計(jì)算均不低于10000，龍血素A峰和B峰的分離度大于1.27，龍血素A的保留時(shí)間約為28 min，龍血素B的保留時(shí)間約為30 min。

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1、2、4、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示龍血素A在20～400 ng、龍血素B在10～200 ng呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。龍血素A、B的回歸方程分別為:Y=3×106X+3294．5，R2=0.999;Y=5 ×106X-4201．7，R2=0.9993。

2.4.6 試驗(yàn)樣品檢測(cè)

分別取待測(cè)樣品和對(duì)照品20 μL進(jìn)樣。按照上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出龍血素A、龍血素B的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

龍血素A與龍血素B在血脂塊中的含量通過(guò)如下公式計(jì)算:龍血素A(或者B)在血脂塊中的含量(mg/g)=［HPLC檢測(cè)樣品濃度(mg/mL)*龍血竭脂塊提取物重量(g)］/［龍血竭脂塊重量(g)*100 mL］，其中，每個(gè)處理中5個(gè)平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值代表該處理后的龍血素A和B的含量。采用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因子方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)不同處理中龍血素A和龍血素B含量之間的差異顯著性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 真菌單獨(dú)培養(yǎng)

圖1 三種不同培養(yǎng)基上真菌的生長(zhǎng)狀況Fig.1 Fungi grown on three different mediums

三種培養(yǎng)基上真菌生長(zhǎng)的狀況明顯不同，結(jié)果如圖1。PDA培養(yǎng)基上真菌長(zhǎng)勢(shì)較好，正面菌絲密集呈白色，背面呈紅褐色;高碳培養(yǎng)基上，真菌幾乎不生長(zhǎng);高氮培養(yǎng)基上，真菌能夠生長(zhǎng)，但是長(zhǎng)勢(shì)一般，正面菌絲稀疏，背面呈粉色。不同溫度環(huán)境下培養(yǎng)的真菌，其代謝產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖2。圖3是標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜，在30 min左右出現(xiàn)兩個(gè)峰a和b，分別表示龍血素A和龍血素B。圖2中30 min位置沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，表明真菌的代謝產(chǎn)物中不含有龍血素A和龍血素B。

3.2 三組不同的處理樣品及空白對(duì)照中龍血素A和龍血素B含量分析

龍血素A的含量在不同的處理中差異不顯著(表1);龍血素B在四組處理中含量差異顯著，在處理②中龍血素B的含量最高，而在處理①和處理③中龍血素B的含量差異不顯著。

3.3 三組不同處理樣品與龍血竭膠囊的指紋圖譜比較

指紋圖譜比較結(jié)果顯示不同處理的樣品的HPLC譜圖與龍血竭膠囊藥品的HPLC譜圖峰形大致相同，前25 min出峰較多，后25 min則比較少。

4 討論

將真菌brwg培養(yǎng)于不同的培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)狀況明顯差異，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)不同對(duì)真菌的生長(zhǎng)有刺激作用。再將培養(yǎng)有真菌的培養(yǎng)基置于不同的溫度環(huán)境下，以溫度作為其另一刺激因素，并檢測(cè)真菌的代謝產(chǎn)物。3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)不同條件下培養(yǎng)的真菌代謝產(chǎn)物，其成分中均不含有龍血素A和龍血素B。而 Maria S.O.［6］和 F.Lecompte［7］等人指出微生物在溫度和不同的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，微生物會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，其代謝產(chǎn)物會(huì)發(fā)生變化。這說(shuō)明龍血素A和龍血素B不是真菌自身應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

表1 不同處理血脂塊中的龍血素A、B含量的檢測(cè)結(jié)果(平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5)Table 1 The contents of loureirin A and loureirin B detected in dragon's bloods induced by different treatments(mean ± SD，n=5)

圖4 不同處理樣品與龍血竭膠囊的HPLC指紋圖譜比較Fig.4 Overlaid HPLC fingerprints of different samples

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示海南龍血樹(shù)樹(shù)體本身含有龍血素A而不含有龍血素B，但是做過(guò)處理的龍血樹(shù)損傷部位受到空氣中微生物或真菌的侵染后均產(chǎn)生龍血素B，表明龍血素B的產(chǎn)生是微生物和龍血樹(shù)相互作用的結(jié)果。

表1顯示經(jīng)過(guò)不同的處理得到的血竭中龍血素A的含量差異不顯著，龍血素B的含量差異顯著，這一結(jié)果說(shuō)明微生物的侵染對(duì)龍血素B的影響較大，而對(duì)龍血素A的影響很小，這也表明龍血素A與龍血素B的形成之間沒(méi)有明顯的關(guān)系，但目前龍血素B的形成機(jī)制仍不明確，所以本實(shí)驗(yàn)結(jié)論需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

龍血素B含量在不同處理樣品中差異顯著。處理①作了打孔處理，受傷部位裸露在空氣中，受到空氣中微生物侵染;處理②在打孔部位接入真菌并將傷口裸露在空氣中，因此受傷部位既受到空氣中微生物的侵染又受到接種真菌的侵染;處理③在打孔部位接入真菌并將傷口扎緊，隔絕空氣，傷口部位僅僅受到接種真菌的侵染。表中結(jié)果顯示處理①、②、③中均含有龍血素B，處理③與處理①中龍血B的含量差異不明顯，而處理②中龍血素B的含量遠(yuǎn)高于處理①、③。王興紅［8］2007年研究表明細(xì)菌、真菌共代謝有利于龍血樹(shù)產(chǎn)生紅色的抑菌分泌物，黃酮類(lèi)成分龍血素B是血竭抑菌作用成分之一［9，10］。因此處理②中龍血素B的含量最高原因可能是龍血樹(shù)的莖干損傷部位受到空氣中的其他真菌及細(xì)菌與人工接入的brwg真菌共同作用，侵染能力增強(qiáng)，從而提高了龍血素B的含量。此外，處理②中接入傷口的菌株可以充分接觸空氣，也可能自身生長(zhǎng)較好增強(qiáng)了其侵染能力，從而增加龍血素B的產(chǎn)量。龍血素B作為龍血竭的主要成分具有較好的抗血栓、抗血瘀、抗凝血等活血化瘀藥理作用［11］，而處理②對(duì)龍血素B的產(chǎn)生誘導(dǎo)效果最佳，從而為人工誘導(dǎo)血竭生產(chǎn)提供了方向。

指紋圖譜比較結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)不同處理后的含脂塊與龍血竭藥品成分相似，真菌的接種沒(méi)有引起組成血竭的各個(gè)組分的明顯變化，保證了血竭品質(zhì)的穩(wěn)定。這進(jìn)一步為人工接菌誘導(dǎo)血竭生產(chǎn)提供依據(jù)。人工接菌方法的優(yōu)勢(shì)在于:打孔傷口小且選擇樹(shù)體的側(cè)枝打孔不會(huì)影響龍血樹(shù)的存活;同一枝條可以同時(shí)多處打孔提高龍血竭產(chǎn)量;人工接入真菌增加了龍血樹(shù)的侵染機(jī)率，縮短了龍血竭生產(chǎn)周期。因此人工接菌方法有望解決目前龍血竭生產(chǎn)面臨的原料枯竭難題。

5 結(jié)論

本研究結(jié)果在支持了前人結(jié)果的基礎(chǔ)上，揭示了不同的接種方法對(duì)血竭中主要藥用成分龍血素A和B在血竭樹(shù)脂中的含量的影響。通過(guò)本研究，對(duì)海南龍血樹(shù)采用樹(shù)枝打孔處理，孔口接入菌種，保持孔口裸露的處理方式，能夠在保證血竭產(chǎn)品中龍血素A成分含量穩(wěn)定的情況下，明顯地增加龍血素B的含量，提高了血竭的品質(zhì)，所以打孔接種的這種高效穩(wěn)定方式，有利于大規(guī)模推廣。

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