褚仕超，孫 彥，劉章武

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

肉類香精是一種具有動(dòng)物肉類制品香味的食用香精，自20世紀(jì)80年代起在我國得到發(fā)展［1］。其廣泛應(yīng)用于新型加香產(chǎn)品中，如方便食品、調(diào)味品、肉制品及膨化休閑食品等，可提高食品品質(zhì)，增添獨(dú)特風(fēng)味。目前，研究人員對禽肉香精［2－7］和海鮮香精［8］進(jìn)行了比較廣泛深入的探索，但對鴨肉香精的研究不多。因?yàn)橄阄丢?dú)特，鴨肉作為湖北的傳統(tǒng)特色產(chǎn)品在本省及全國都非常受歡迎。為滿足潛在市場需求，對鴨肉蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)乃饧纯傻玫斤L(fēng)味純正、香氣逼真的鴨肉香精。其中酶法水解蛋白因其獨(dú)特優(yōu)勢，已逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸堿水解法，成為更加高效的水解方法［9－11］。為制備風(fēng)味好、香型真的鴨肉香精，利用不同組合的蛋白酶對鴨肉進(jìn)行水解，為后面利用美拉德反應(yīng)制得香味逼真的鴨肉香精打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨肉由精武公司提供;肉類水解專用酶和風(fēng)味蛋白酶均來自廣西南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;氫氧化鈉、鹽酸、甲醛等均為分析試劑純。

1.2 儀器與設(shè)備

FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)(金壇市醫(yī)療儀器廠);TDL-40型飛鴿離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);90-2型定時(shí)恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠);pH計(jì)(Delta320，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司);HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠);SYC15超級智能恒溫水槽(鞏義市英峪予華儀器廠);JBT/C-YCL400T/3(C)超聲波處理機(jī)(濟(jì)寧金百特公司)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測定

凱氏定氮法［12］

1.3.2 蛋白質(zhì)水解度(DH)的測定

DH=上清液中的氨基態(tài)氮/鴨肉樣品中總氮量×100%

1.3.3 氨基酸氮含量的測定

雙指示劑甲醛滴定法［13］.

1.3.4 酶解方法

將去皮的鴨腿肉解凍后絞碎，按1∶4的料液比將鴨肉與蒸餾水勻漿，然后通過超聲波預(yù)處理后［14－15］，調(diào)節(jié)至特定 pH 值，將樣品放入適當(dāng)溫度的恒溫水浴鍋中加熱，再加入蛋白水解酶酶解適當(dāng)時(shí)間。最后將酶解液在90℃條件下滅酶10 min，然后離心并取上清液，靜置至室溫后測其水解度［16］。

1.3.5 酶解的單因素試驗(yàn)

為選定酶解過程中的最適工藝條件，選取不同的復(fù)合酶酶比、加酶量、水解時(shí)間、初始pH值、水解溫度等5個(gè)因素來進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.6 酶解的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用復(fù)合酶酶比、加酶量、水解時(shí)間、初始pH值、水解溫度等5個(gè)因素中的合適參數(shù)進(jìn)行五因素四水平正交試驗(yàn)，從而確定最優(yōu)酶解條件。正交試驗(yàn)的各因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 最佳復(fù)合酶比的確定

肉類水解專用酶與風(fēng)味蛋白酶的比例不同對酶解反應(yīng)會(huì)有影響。選定酶解條件為:pH7.5，溫度55℃，加酶量0.3%(W/W)，在肉類水解專用酶:風(fēng)味蛋白酶為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 的條件下，將鴨肉漿水解4h后，升溫滅酶，并測定其水解度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 不同酶比對水解的影響

由圖1可知，不同的酶比的酶解度也不同。酶解度與酶比之間的關(guān)聯(lián)呈先升后降趨勢，當(dāng)肉類水解專用酶∶風(fēng)味酶為2∶1時(shí)，酶解度最高，達(dá)到34.41%。

2.1.2 最佳加酶量的確定

選定酶解條件為:pH 7.5，溫度55℃，酶比為2∶1，分別在加酶量為 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%(W/W)的條件下，對鴨肉漿水解4 h，酶解結(jié)束后升溫滅酶，并測定其水解度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 不同加酶量對水解度的影響

由圖2可知，加酶量的不同對酶解度的影響呈現(xiàn)出先上升后趨于平衡的趨勢。當(dāng)加酶量小于0.3%時(shí)，加酶量增加，水解度增大，而當(dāng)加酶量大于0.3%時(shí)，水解度基本上沒什么變化。由于加酶量在0.3%時(shí)所得水解液顏色質(zhì)地清亮，風(fēng)味比較好。所以從經(jīng)濟(jì)成本和風(fēng)味方面兩方面考慮，確定加酶量為 0.3%。

2.1.3 水解時(shí)間的確定

選定酶解條件為:溫度55℃，pH7.5，加酶量為0.3%(W/W)，肉類水解專用酶∶風(fēng)味蛋白酶 =2∶1，對鴨肉漿水解8 h，每隔1 h取樣滅酶，并測定其水解度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

從圖3可知，水解時(shí)間增加，鴨肉蛋白的水解度也增加。在反應(yīng)的前4個(gè)小時(shí)，水解度增加得比較快，4個(gè)小時(shí)后水解度變化趨緩。這主要是由于剛加入酶時(shí)，底物濃度較高，反應(yīng)速率隨著酶的不斷加入而變快。當(dāng)鴨肉蛋白質(zhì)底物逐漸被酶解后，底物濃度下降，酶解速率也隨之下降。同時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間越來越長，溫度越來越高，也可使部分酶發(fā)生變性，導(dǎo)致酶解后段速度下降。而且實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)水解時(shí)間超過4 h后，水解液風(fēng)味開始變差，所以綜合考慮后選定鴨肉水解最適宜時(shí)間為4 h。

圖3 不同水解時(shí)間對水解度的影響

2.1.4 最佳酶解溫度的確定

溫度影響酶的活力，同時(shí)也會(huì)影響酶解過程中輕度發(fā)生的美拉德反應(yīng)，從而對酶解液的風(fēng)味和色澤產(chǎn)生影響。選定酶解條件為:pH7.5，加酶量為0.3%(W/W)，肉類水解專用酶∶風(fēng)味酶=2∶1，分別在45℃、50℃、55℃、60℃下，對鴨肉漿水解4h，酶解后升高溫度對其滅酶，并測定其水解度。其結(jié)果見圖4。

圖4 不同水解溫度對水解度的影響

由圖4可知，選擇合適的酶解溫度對酶解反應(yīng)的速率具有重要的影響，且水解液的風(fēng)味和色澤也會(huì)受溫度的影響。當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的增加，水解度也逐步上升，達(dá)到33.20%。當(dāng)溫度超過50℃時(shí)，酶解度也漸漸降低。這主要是由于酶具有最適反應(yīng)溫度，在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度升高，酶活力增大，酶促反應(yīng)速率加快。當(dāng)酶超過其適應(yīng)溫度范圍變性后，酶的活性便會(huì)降低。因此，確定酶解溫度為50℃。

2.1.5 水解最佳pH的確定

選定酶解條件為:溫度55℃，加酶量為0.3%(W/W)，肉類水解專用酶與風(fēng)味酶酶比為2∶1，分別在 pH 為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的條件下，對鴨肉漿水解4 h，酶解后迅速升溫滅酶，并測定其水解度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可見，不同的pH下，酶解反應(yīng)的速度也會(huì)不同，pH偏高或偏低都不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。因?yàn)槊赣凶钸m酸堿范圍，過酸或過堿都會(huì)影響到酶的活性和穩(wěn)定性，從而影響酶解反應(yīng)的速度，使得酶解反應(yīng)的水解度下降。因此，確定酶解pH為7.5。

圖5 不同pH對水解度的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為更全面的照顧到各單因素對酶解效果的影響，實(shí)驗(yàn)將水解度作為優(yōu)化指標(biāo)，對復(fù)合酶的酶比、加酶量、水解溫度、水解時(shí)間和pH等5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。表1為酶解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平，表2為酶解實(shí)驗(yàn)正交設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 酶解的因素和水平

表2 酶解的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 最佳酶解條件的確定

對正交表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，可以看出，各單因素對水解度的影響從大到小分別為:pH、水解溫度、酶比、水解時(shí)間、加酶量。而最佳的試驗(yàn)組合為:酶比2∶1，水解時(shí)間5 h，水解溫度50℃，加酶量0.3%(W/W)，pH7.5。但該組合并沒有出現(xiàn)在正交實(shí)驗(yàn)中，通過補(bǔ)充該組實(shí)驗(yàn)可知，在所得水解度為34.1%時(shí)，最佳水解條件為:酶比2∶1，水解時(shí)間5 h，水解溫度50 ℃，加酶量0.3%(W/W)，pH7.5。

3 結(jié)論

在鴨肉酶解的初段，隨著時(shí)間的增加，水解度也快速的增長，而到了酶解后期，水解度隨時(shí)間的增加就會(huì)增長得比較緩慢。對水解度影響比較明顯的還有水解溫度和起始pH，溫度過高或者過低，以及水解環(huán)境過酸或者過堿都會(huì)影響酶的活性，從而導(dǎo)致水解度相對比較低。達(dá)到一定數(shù)值的加酶量，如果繼續(xù)加大加酶量，水解度上升便會(huì)變得緩慢。其主要原因在于，在一定底物濃度下，加酶量較低時(shí)，酶可能已經(jīng)飽和，于是加酶量越大，酶解速率就會(huì)越高。進(jìn)一步增加加酶量，酶的濃度在反應(yīng)體系中升高，兩種酶之間就會(huì)產(chǎn)生相互抑制，水解度的變化就不會(huì)太明顯。此外，試驗(yàn)還研究了不同配比下肉類水解專用酶和風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合酶對水解度的影響，結(jié)果表明，不同比例的復(fù)合酶，水解度也會(huì)有差異。

正交實(shí)驗(yàn)及其分析對復(fù)合蛋白酶水解工藝所進(jìn)行的優(yōu)化，可以得出酶解的最佳工藝條件為:酶解時(shí)間5 h;酶解溫度50℃;酶解起始pH 7.5;酶比為肉類水解專用酶∶風(fēng)味蛋白酶=2∶1;加酶量0.3%(W/W)。而通過研究人員在其他肉類香精方面的研究可知，肉類蛋白酶解液的水解度在30%左右時(shí)進(jìn)行Maillard反應(yīng)便于形成較好的肉類香氣和風(fēng)味。［17－18］

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