朱永哲，馮雅男，金正漢

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，青島 266109；2.首爾大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)學(xué)院，首爾 151742，韓國(guó)）

糧食作物等食品在全球范圍內(nèi)的需求日益增加，為提高產(chǎn)量，農(nóng)藥的使用越來(lái)越廣泛［1］。然而農(nóng)藥是環(huán)境中最危險(xiǎn)的污染物之一，過(guò)度使用和濫用對(duì)環(huán)境和人類健康都會(huì)造成很大的不利影響。農(nóng)藥施用不當(dāng)，其殘留物會(huì)進(jìn)入到土壤、空氣、地表水和地下水，甚至進(jìn)入食物鏈從而對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)造成破壞［2］。因此，在環(huán)境質(zhì)量評(píng)估中，土壤中的農(nóng)藥殘留分析已成為不可或缺的一部分。

對(duì)樣品進(jìn)行分析時(shí)，由于分析物的化學(xué)性質(zhì)不同、基質(zhì)復(fù)雜、分析濃度較低，必須對(duì)樣品進(jìn)行前處理［3］。而耕地土壤成分復(fù)雜，用藥史不確定性高，所以確定土壤前處理的方法更加重要。近幾年，大量農(nóng)藥殘留分析的樣品前處理趨于簡(jiǎn)單化和環(huán)境友好，QuEChERS方法［4，5］是一種快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效、耐用、安全的樣品前處理方法，在水稻［6］、水果［7-12］、蔬菜［8，11-13］、茶葉［14］等食品安全領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。也有一些利用QuEChERS檢測(cè)土壤中農(nóng)藥殘留的報(bào)道，比如Lesueur等［1］采用QuEChERS-HPLC-MS／MS測(cè)定土壤中24種農(nóng)藥的殘留，平均回收率為72.7%；Caldas等［15］用LCAtmosphere Pressure Chemical Ionization（APCI）-MS／MS測(cè)定水稻田土壤中5種農(nóng)藥的殘留，回收率為70.3%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于18.2%；Dro˙zd˙zyński等［16］用 UPLC-MS／MS測(cè)定土壤中 4種殺蟲(chóng)劑的殘留，回收率在67%～108%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12%；梅梅等［17］用QuEChERS方法測(cè)定土壤中5種除草劑的殘留量，在4和40μg／kg水平下平均加標(biāo)回收率為75.4%～98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～11.8%。但未見(jiàn)測(cè)定土壤中幾百種農(nóng)藥的相關(guān)報(bào)道。

耕地土壤經(jīng)過(guò)多種作物的種植后，用藥史復(fù)雜且難以確定，這使得耕地土壤中含有的農(nóng)藥極為復(fù)雜。當(dāng)樣品中含有的農(nóng)藥有上百種甚至更多時(shí)，分組測(cè)試消耗時(shí)間多，且浪費(fèi)大量試劑。本研究擬采用AOAC（Association of Official Analytical Chemists）QuEChERS［5］方法對(duì)土壤樣品進(jìn)行前處理，不經(jīng)過(guò)凈化過(guò)程，對(duì)239種極性不同的農(nóng)藥同時(shí)分析，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS／MS）檢測(cè)，確立短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)其殘留的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC-MS／MS 8030液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（日本Shimadzu公司）；HM-200電子天平（日本A＆D公司）；Combi 408離心機(jī)和Micro 17TR高速離心機(jī)（韓國(guó)Hanil公司）；Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；Reacti-Thermo干式加熱氮?dú)獯蹈蓛x（美國(guó)Thermo公司）；Labostar 7TWF-UV超純水機(jī)（德國(guó)Siemens公司）；Branson 5510超聲波清洗機(jī)（美國(guó)Branson公司）；Vortex-2渦旋混合器（美國(guó)Scientific公司）。

丙酮、乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Honeywell公司）；甲酸、甲酸銨（色譜純，德國(guó)Fluka公司）；AOAC QuEChERS萃取鹽（6g無(wú)水硫酸鎂，1.5g乙酸鈉，美國(guó)安捷倫公司）。239種農(nóng)藥（見(jiàn)表1）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司、美國(guó)Chem service公司、德國(guó)Fluka公司等。

表1 UPLC-MS／MS分析239種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)、檢出限以及基質(zhì)效應(yīng)Table 1 The MS parameters，limits of detection（LODs）and matrix effects of the 239 pesticides analyzed by UPLC-MS／MS

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

土壤樣品采于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)田，常溫條件下自然風(fēng)干10個(gè)月后，過(guò)20目篩儲(chǔ)存，用作土壤空白樣品。

1.2 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液:準(zhǔn)確稱取5mg（精確至0.1 mg）各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，分別根據(jù)各自的溶解度選用甲醇、丙酮、乙腈等溶劑定容至5mL，得到239種農(nóng)藥的單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000mg／L），于-18℃避光密封儲(chǔ)存。再用甲醇分別稀釋單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，得到100、10、5和1mg／L的農(nóng)藥工作液各10 mL，于-4℃儲(chǔ)存，用于對(duì)農(nóng)藥質(zhì)譜條件的優(yōu)化和混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液的配制。

混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液:量取100mg／L的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液各3mL，依次添加、蒸干后用甲醇定容為30mL，得到10mg／L的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃避光密封儲(chǔ)存。

基質(zhì)混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液:用土壤空白提取液配制200，100，50，20，10，5，1μg／L的系列濃度基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)液，用于基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。

1.3 樣品前處理

稱取5g土壤樣品，置于50mL離心管中，依次加入水（5mL）、乙腈（10mL）、AOAC QuEChERS萃取鹽包，劇烈振蕩2min后用冰冷卻，離心（3500 r／min，5min）。吸取400μL上清液，加入含0.5%（如無(wú)特殊說(shuō)明均為體積分?jǐn)?shù)）甲酸的100μL乙腈，過(guò)0.2μm濾膜后待測(cè)。

1.4 UPLC-MS／MS條件

1.4.1 UPLC條件

Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100mm×2.1mm，2.6μm）；流 動(dòng) 相 A 為 水 溶 液 （含 5 mmol／L甲酸銨，0.1%甲酸），B為甲醇溶液（含5 mmol／L甲酸銨，0.1%甲酸）；流速0.5mL／min；柱溫40℃；進(jìn)樣體積10μL。線性梯度洗脫程序:0～0.5min，0%B；0.5～1min，0%B～55%B；1～8 min，55%B～95%B；8～10min，95%B；10～15 min，0%B。

1.4.2 MS條件

電噴霧離子源（ESI）；正、負(fù)離子掃描方式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；接口電壓:4.5kV；霧化氣體流速:3L／min；霧化溫度:400℃；脫溶劑氣體流速:15 L／min；脫溶劑溫度:250℃；碰撞誘導(dǎo)電離氣體壓力:230kPa。各個(gè)農(nóng)藥的質(zhì)譜采集參數(shù)（母離子、碎片離子、Q1電壓、碰撞能量、Q3電壓）見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 MS條件優(yōu)化

分別取10μL的239種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液（1mg／L），在流動(dòng)相存在的條件下進(jìn)入離子源，在正、負(fù)離子掃描同時(shí)檢測(cè)模式下對(duì)各農(nóng)藥進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析（全掃描模式），得到農(nóng)藥母離子；對(duì)各農(nóng)藥母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析（碎片離子掃描），確定碎片離子，并優(yōu)化各農(nóng)藥的Q1電壓、碰撞能量、Q3電壓等參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 UPLC條件優(yōu)化

2.2.1 液相色譜柱的選擇

分析幾百種農(nóng)藥時(shí)，尤其是分析物極性差異較大時(shí)，大粒徑和大內(nèi)徑的色譜柱對(duì)農(nóng)藥的分離度不夠理想［18］。實(shí)驗(yàn)中選用Phenomenex Kinetex C18（100mm×2.1mm，2.6μm）和Phenomenex Kinetex XB-C18（100mm×2.1mm，1.7μm）2種小粒徑色譜柱進(jìn)行比較，對(duì)100μg／L的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行UPLC-MS／MS分析。這2種色譜柱均可在10min之內(nèi)完成239種農(nóng)藥的分離檢測(cè)。分析2種色譜柱條件下的總離子流圖（見(jiàn)圖1），粒徑為2.6 μm的色譜柱可以使混合農(nóng)藥更好的分離，靈敏度更高。

圖1 不同色譜柱條件下UPLC-MS／MS方法分析混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液（100μg／kg）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of mixed standard pesticides（100μg／kg）with two different columns by UPLC-MS／MS

2.2.2 流動(dòng)相梯度的選擇

農(nóng)藥多殘留分析中，流動(dòng)相梯度不同，保留時(shí)間、峰形和靈敏度都會(huì)改變。選擇流動(dòng)相流速時(shí)，發(fā)現(xiàn)出峰時(shí)間較早的乙酰甲胺磷（100μg／L）有拖尾現(xiàn)象，所以選擇乙酰甲胺磷為代表，優(yōu)化流動(dòng)相梯度（見(jiàn)表2）。采用梯度4時(shí)，乙酰甲胺磷的峰形和靈敏度最好（見(jiàn)圖2）。用梯度4在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，對(duì)100μg／L的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分析，10 min內(nèi)239種農(nóng)藥完全分離，且峰形尖銳，檢測(cè)效率較高。各農(nóng)藥的保留時(shí)間見(jiàn)表1。

表2 用于優(yōu)化的4種流動(dòng)相洗脫梯度Table 2 Four kinds of mobile phase gradient used for optimization

2.3 方法的線性關(guān)系和檢出限

用甲醇配制1、5、10、20、50、100、200μg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)液，以各組分峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg／L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。239種農(nóng)藥在1～200μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，除去滅草松（r2＝0.9889）、氯氟吡氧乙酸（r2＝0.9878）、敵百蟲(chóng)（r2＝0.9871）外，其他236種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)（r2）均在0.9911～1.000。且混合標(biāo)準(zhǔn)液中各個(gè)農(nóng)藥的峰形、峰面積與單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液的峰形、峰面積相差不多，說(shuō)明多種農(nóng)藥混合后穩(wěn)定性良好。按照3倍信噪比（S／N＝3）計(jì)算土壤中農(nóng)藥的檢出限為0.69～29.04μg／kg（見(jiàn)表1）。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)的存在可能增強(qiáng)或抑制離子強(qiáng)度。不僅樣品基質(zhì)、化合物本身對(duì)離子強(qiáng)度有影響，分析時(shí)溶液的濃度也會(huì)產(chǎn)生影響。稱取土壤樣品按照1.3節(jié)方法處理，上述條件下檢測(cè)提取液未發(fā)現(xiàn)樣品中含有農(nóng)藥。然后用土壤空白樣品提取液配制得到1、5、10、20、50、100和200μg／L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)液，以各組分峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg／L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)平均基質(zhì)效應(yīng)（ME，增強(qiáng)或抑制）大于20%時(shí)，認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量檢測(cè)有顯著影響，不可忽略?；|(zhì)效應(yīng)可以通過(guò)方程（1）計(jì)算:

圖2 不同流動(dòng)相梯度下乙酰甲胺磷的UPLC-MS／MS色譜圖Fig.2 Chromatograms of acephate with four mobile phase gradients analysed by UPLC-MS／MS

式中Sm為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Ss為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

按1.3節(jié)方法對(duì)土壤樣品進(jìn)行提取，其中111種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)小于20%，對(duì)137種農(nóng)藥產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)，僅對(duì)乙氧喹啉產(chǎn)生了抑制作用（見(jiàn)表1）。所以在進(jìn)行加標(biāo)回收率計(jì)算時(shí)，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，以減小基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響。

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精確度

方法的準(zhǔn)確度和精確度通常用加標(biāo)樣品的回收率和重復(fù)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表達(dá)。被分析物較少時(shí)，樣品回收率在70%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于20%時(shí)實(shí)驗(yàn)方法是可行的。在本研究中，向空白土壤中添加8和40μg／kg水平的239種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定3次，按照1.3節(jié)的方法進(jìn)行提取，得到的各農(nóng)藥的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3，相關(guān)數(shù)據(jù)的柱狀圖見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，添加水平為8μg／kg時(shí)有138種農(nóng)藥回收率在70%～120%內(nèi)，占總數(shù)的58%；其中75種RSD小于10%，131種RSD小于20%。添加水平為40 μg／kg添加水平時(shí)，有209種的回收率在70%～120%范圍內(nèi)，占總數(shù)的87%；其中RSD小于10%的有141種，RSD小于20%的有209種。

圖3 UPLC-MS／MS測(cè)定不同添加水平下的各回收率范圍的農(nóng)藥個(gè)數(shù)占總數(shù)的百分?jǐn)?shù)Fig.3 Percentages of the pesticides in total pesticides within each recovery range at different spiked levels analysed by UPLC-MS／MS

根據(jù)國(guó)際農(nóng)藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)，當(dāng)被分析的農(nóng)藥達(dá)到幾百種時(shí)，回收率在50%～150%范圍內(nèi)，RSD小于20%的方法是可行的［11，19］。我們分析了回收率在50%～150%范圍內(nèi)的結(jié)果，添加水平為8μg／kg時(shí)，222種農(nóng)藥符合標(biāo)準(zhǔn)，其中RSD小于10%的有121種，RSD大于10%但小于20%的有214種；添加水平為40μg／kg時(shí)，所有檢測(cè)農(nóng)藥均符合標(biāo)準(zhǔn)，其中RSD小于10%的有161種，RSD大于10%但小于20%的有239種。

表3 土壤中農(nóng)藥平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝3）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations（RSD）of the pesticides in soil（n＝3）

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

當(dāng)多種極性不同的農(nóng)藥混合在一起時(shí)會(huì)互相影響，降低靈敏度。本研究在8和40μg／kg的添加水平上，239種農(nóng)藥均獲得了了較好的分析結(jié)果。相對(duì)之前的研究［1，15，16，20］，添加濃度較低。近年來(lái)，農(nóng)藥殘留限量越來(lái)越低，該研究方法可以達(dá)到檢測(cè)低水平多農(nóng)藥殘留的要求。

3 結(jié)論

本文建立了一種基于QuEChERS-UPLC-MS／MS的方法，可在10min內(nèi)同時(shí)測(cè)定土壤中的239種農(nóng)藥殘留量。選取了8和40μg／kg的加標(biāo)水平進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度和精確度良好。本方法滿足土壤中多殘留農(nóng)藥檢測(cè)要求，而且高效、快速、簡(jiǎn)單、靈敏度高、確認(rèn)性和實(shí)用性強(qiáng)，可作為土壤中多殘留農(nóng)藥檢測(cè)的常規(guī)方法。

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