云 環(huán)， 劉 鑫， 王 靜， 嚴(yán) 華， 崔鳳云， 張朝暉

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，北京 100026）

分子結(jié)構(gòu)中含有偶氮基（-N＝N-）的染料統(tǒng)稱為偶氮染料，其偶氮基常與一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)系統(tǒng)相連構(gòu)成一個(gè)共軛體系而作為染料的發(fā)色體，幾乎分布于所有的顏色，廣泛用于紡織品、皮革制品等染色及印花工藝。研究表明，用致癌芳香胺合成的偶氮染料受到人體腸道細(xì)菌以及偶氮還原酶的作用而易于發(fā)生偶氮還原裂解，重新釋放出致癌芳香胺，從而產(chǎn)生致癌作用［1］。德國(guó)、歐盟、日本及我國(guó)都明文規(guī)定：對(duì)于檢測(cè)出禁用偶氮染料的紡織品一律禁止生產(chǎn)和銷售。

傳統(tǒng)的芳香胺檢測(cè)方法，如氧化顯色法［2］、重氮偶合法［3］、紙色譜法［4］、薄層色譜法［5］、特定顯色劑法［6］等，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，對(duì)分析人員的技術(shù)要求比較高，且常常受到樣品量太小的限制而難以奏效。常見的儀器分析法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［7-11］、液相色譜法［12］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［13，14］。靜電場(chǎng)軌道阱（orbitrap）高分辨質(zhì)譜具有質(zhì)量分辨率高和能提供精確相對(duì)分子質(zhì)量的功能，在全掃描模式下采集的數(shù)據(jù)可以根據(jù)檢測(cè)需求反復(fù)調(diào)用，由此彌補(bǔ)傳統(tǒng)低分辨質(zhì)譜方法無法應(yīng)對(duì)法規(guī)更新頻繁的不足；其數(shù)據(jù)依賴性掃描（data-dependent scan）可以在篩查的同時(shí)，通過碎片離子進(jìn)行定性確證；近年來其在食品檢測(cè)、蛋白質(zhì)組學(xué)［15，16］等方面已開始逐漸應(yīng)用，但在紡織品檢測(cè)領(lǐng)域尚屬空白。

本文建立了高效液相色譜-線性離子阱／靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC-LTQ／Orbitrap MS）快速篩查確證紡織品中禁用偶氮染料的方法。采用全掃描和正離子切換模式進(jìn)行測(cè)定，通過提取一級(jí)質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量，自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)全掃描質(zhì)譜進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確性。該方法和現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道方法相比更為快速、準(zhǔn)確，實(shí)際樣品測(cè)定驗(yàn)證了其高靈敏度和可靠性，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HPLC-LTQ-Orbitrap XL高效液相色譜-線性離子阱／靜電場(chǎng)軌道阱組合質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó) Millipore公司）；微孔濾膜（0.20μm，美國(guó)Pall公司）；超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；小型高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；Chromabond XTR偶氮萃取柱（14.5g／70mL，德國(guó) Macherey-Nagel公司）。

21種致癌芳香胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、叔丁基甲醚（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；檸檬酸、氫氧化鈉、連二亞硫酸鈉（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；實(shí)驗(yàn)用水均由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。0.06mol／L檸檬酸鹽緩沖溶液（pH 6）：取12.526g檸檬酸和6.320g氫氧化鈉溶于水，定容至1000mL即得。21種致癌芳香胺的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇配制，系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用甲醇-水（2∶8，v／v）配制。

1.2 樣品前處理

將樣品剪成5mm×5mm小片，稱取1.0g，加入17mL預(yù)熱到（70±2）℃的檸檬酸鹽緩沖溶液，振搖，置于（70±2）℃水浴中30min；加入3.0mL 200g／L連二亞硫酸鈉溶液，置于（70±2）℃水浴中30min，冷卻至室溫。提取液倒入硅藻土提取柱內(nèi)，吸附15min。用80mL叔丁基甲醚分4次反復(fù)洗提反應(yīng)器中的試樣，合并入提取柱中。收集叔丁基甲醚提取液，于35℃低真空下濃縮至1mL，再用氮?dú)鉂饪s至近干。1mL甲醇溶解并定容，過0.2μm微孔濾膜，濾液待測(cè)。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50mm×2.1mm，1.7μm；美國(guó) Waters公司）。流動(dòng)相 A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫程序：0～5.0min，90%A～5%A；5.0～7.0min，5%A；7.0～7.1min，5%A～90%A；7.1～8.0min，90%A。流速：0.25mL／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：5.0μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；毛細(xì)管溫度350℃，鞘氣（N2）流速為17L／min（即30arb），輔助氣（N2）流速8 L／min（即10arb）；在正離子模式下用Orbitrap檢測(cè)器全掃描（full scan）和data-dependent scan模式檢測(cè)；全掃描的分辨率R＝60000；data-dependent scan模式：當(dāng)Event 1中的檢測(cè)信號(hào)超過Parent List中化合物的設(shè)定閾值時(shí)，自動(dòng)觸發(fā)Event 2；二級(jí)質(zhì)譜采用碰撞誘導(dǎo)解離（CID）方式產(chǎn)生碎片離子，碰撞裂解氣為高純氦氣，碰撞能量為35%。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜電離條件的選擇

CID電壓是串聯(lián)質(zhì)譜中影響碎片離子強(qiáng)度的重要參數(shù)，對(duì)檢測(cè)靈敏度和特征離子碎片信息的豐度有直接影響。當(dāng)CID電壓較低時(shí)，目標(biāo)碎片離子峰強(qiáng)度較弱，靈敏度相對(duì)較差；當(dāng)CID電壓超過一定強(qiáng)度，會(huì)產(chǎn)生過多的碎片離子而影響目標(biāo)碎片離子的甄別。質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果為：CID電壓在35%時(shí)，21種芳香胺分別得到各自特征的碎片，且分子離子峰和特征碎片離子峰的豐度比例相對(duì)穩(wěn)定，可以達(dá)到對(duì)待測(cè)物質(zhì)的定性及定量要求。歐盟EC 2002／657［17］規(guī)定：使用高分辨質(zhì)譜時(shí)，母離子識(shí)別點(diǎn)是2.0，子離子識(shí)別點(diǎn)是2.5，禁用物質(zhì)的識(shí)別點(diǎn)是4.0。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)通過一級(jí)母離子篩查和二級(jí)CID碎片離子確證對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。21種致癌芳香胺的MS分析參數(shù)見表1。

表1 21種致癌芳香胺的HPLC-LTQ／Orbitrap MS分析參數(shù)Table 1 HPLC-LTQ／Orbitrap MS analysis parameters of the 21 carcinogenic aromatic amines

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定偶氮染料的還原產(chǎn)物芳香胺時(shí)采用的流動(dòng)相均為甲醇-磷酸緩沖鹽體系，但是使用緩沖鹽體系時(shí)負(fù)載較大，會(huì)極大地影響色譜柱的使用壽命，而且磷酸鹽為非揮發(fā)性酸，易污染離子源，與質(zhì)譜儀不能兼容。將流動(dòng)相由甲醇-磷酸緩沖鹽體系改為甲醇-水體系后，試驗(yàn)結(jié)果顯示各物質(zhì)的峰形不好。在實(shí)際的反相液相色譜工作中，一般直接用酸或堿調(diào)節(jié)pH值來抑制弱解離化合物的離解。本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相的水相中加入甲酸，采用梯度洗脫方式，21種致癌芳香胺可以得到有效的分離。21種致癌芳香胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流（TIC）色譜圖和CID質(zhì)譜圖見附圖（http：／www.chrom-China.com／UserFiles／File／sp1301031-Fig.doc）。

2.3 樣品的提取和凈化

2.3.1 還原時(shí)間

禁用偶氮染料檢測(cè)的原理為：染料在檸檬酸鹽緩沖溶液介質(zhì)中用連二亞硫酸鈉還原分解，檢測(cè)其分解產(chǎn)物中的致癌芳香胺。偶氮染料是否還原充分直接影響檢測(cè)結(jié)果：還原時(shí)間不夠會(huì)降低偶氮染料的被還原程度，致使檢測(cè)結(jié)果偏低；還原時(shí)間較長(zhǎng)又會(huì)增加檢測(cè)成本，延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)效率。本實(shí)驗(yàn)就還原時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示：對(duì)于棉質(zhì)樣品，還原時(shí)間為10min時(shí)偶氮染料還未完全還原；還原時(shí)間延長(zhǎng)至15min時(shí)還原充分；繼續(xù)延長(zhǎng)還原時(shí)間，發(fā)現(xiàn)還原效果無明顯改善。這是由于棉質(zhì)樣品易被充分浸透，有利于還原反應(yīng)的發(fā)生。但是對(duì)于滌綸等材質(zhì)樣品時(shí)，還原時(shí)間為20min才能充分還原。由于紡織品材質(zhì)種類復(fù)雜，染料種類也較多，建議還原時(shí)間定為30min以保證充分還原。

2.3.2 萃取試劑的選擇

偶氮染料檢測(cè)的常用萃取試劑為乙醚，但乙醚儲(chǔ)存過程中易產(chǎn)生過氧化物，使用之前需通過硫酸亞鐵溶液處理及蒸餾將其中的氧化物去除。該去除過程較為危險(xiǎn)，易引起爆炸。而叔丁基甲醚儲(chǔ)存穩(wěn)定，不易生成過氧化物。本研究對(duì)未經(jīng)過處理的乙醚、處理過的乙醚、叔丁基甲醚的萃取效果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示：未經(jīng)處理的乙醚的萃取效率約為處理過的乙醚的1／2；處理過的乙醚和叔丁基甲醚效果相差無幾，但叔丁基甲醚作萃取劑的結(jié)果比乙醚作萃取劑的結(jié)果更為穩(wěn)定。綜合安全因素，本研究選用叔丁基甲醚作為萃取劑。

2.4 線性范圍、定量限、回收率和精密度

分別配制 0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg／L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以各致癌芳香胺的峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，在0.05～2.00mg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.99）。在空白樣品中進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，前處理后按加標(biāo)濃度由高至低檢測(cè)，以信噪比等于10（S／N＝10）對(duì)應(yīng)的濃度確定為定量限（LOQ）。本實(shí)驗(yàn)中，在0.08 mg／kg添加水平上，所有21種致癌芳香胺的儀器信噪比均大于10，確定該方法的LOQ可達(dá)到0.08 mg／kg。在棉、滌綸兩種樣品中添加21種致癌芳香胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為0.5、1.0和2.0 mg／kg，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，回收率范圍在65.5%～111.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.87%～2.49%（見表2）。

表2 空白樣品中3個(gè)加標(biāo)水平的21種致癌芳香胺的回收率范圍及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recovery ranges and RSDs of the 21 carcinogenic aromatic amines at three spiked levels

2.5 方法的應(yīng)用

將建立的方法應(yīng)用于50份實(shí)際紡織品樣品的檢測(cè)，從中檢出2份樣品含有對(duì)氯苯胺，1份含有聯(lián)苯胺和3，3′-二氯聯(lián)苯胺，1份含有2-萘胺，其余樣品未檢出。

3 結(jié)論

本文建立的紡織品中禁用偶氮染料的快速、高通量的高效液相色譜-線性離子阱／靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)方法，在8min內(nèi)完成了對(duì)21種致癌芳香胺的篩查和確證，獲得了滿意的分離效果和檢測(cè)靈敏度。方法的定量限滿足國(guó)內(nèi)外相關(guān)禁用偶氮染料的檢測(cè)要求，可作為一種快速篩查和確證檢測(cè)技術(shù)廣泛使用。

［1］Lu S Y，Guan Z W.Journal of Environment and Health（魯生業(yè)，官志文.環(huán)境與健康雜志），2002，19（5）：355

［2］Pinheiroa H M，Touraudb E，Thomas O.Dyes Pigments，2004，61：121

［3］Yu L Y，Sun Y，Jin J.West Leather（俞凌云，孫艷，金晶.西部皮革），2011，33（8）：49

［4］Peng B，Xiao Q.China Textile Leader（鵬搏，曉琴.紡織導(dǎo)報(bào)），1998（1）：41

［5］GB／T 17592.1～3-1998

［6］Li H Y.Chemistry ＆Bioengineering（李海燕.化學(xué)與生物工程），2006，23（8）：55

［7］Qian W J，Ruan Y，Zhang W D，et al.Shanghai Textile Science ＆Technology（錢微君，阮勇，張衛(wèi)娣，等.上海紡織科技），2010，38（5）：55

［8］Zhang W H，Sun Z S，Zhang Q Z，et al.Science and Technology Innovation Herald（張文皓，孫忠松，張清智，等.科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)），2010（3）：117

［9］Shao Q R，F(xiàn)ang X Y，Ding X.Chinese Journal of Analysis Laboratory（邵秋榮，方邢有，丁曉.分析試驗(yàn)室），2010，29（Suppl）：417

［10］Yang J S，Xu Y Y，Jiang H.Dyeing and Finishing（楊繼生，徐逸云，蔣華.印染），2005（6）：37

［11］Shao X G，Li M Q.Chinese Journal of Chromatography（邵學(xué)廣，李梅青.色譜），2001，19（2）：184

［12］Wang H H，Niu Z Y，Ye X W，et al.Journal of Instrumental Analysis（王卉卉，牛增元，葉曦文，等.分析測(cè)試學(xué)報(bào)），2009，28（8）：944

［13］Tang C J，Nie J M，Wang X N，et al.Chinese Journal of Analysis Laboratory（唐川江，聶錦梅，王曉寧，等.分析試驗(yàn)室），2011，30（9）：75

［14］Ma Q，Bai H，Wang C，et al.Chinese Journal of Analytical Chem-istry（馬強(qiáng)，白樺，王超，等.分析化學(xué)），2010，38（1）：51

［15］Ye H Y，Zheng S Q，Liang C，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（葉海英，鄭水慶，梁晨，等.分析化學(xué)），2012，40（11）：1674

［16］Chen J X，Deng J W，Chen H，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（陳建新，鄧潔薇，陳紅，等.分析化學(xué)），2011，39（12）：1858

［17］Council Directive 96／23／EC