李佳楠，鐘小忠，王 婷

（1.江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，湖北 武漢 430056； 2.成都大學(xué)，四川 成都 610041）

臨床外科手術(shù)止血，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)外科手術(shù)中如何快速止血是一個(gè)難點(diǎn)。快速止血可使流血所造成的神經(jīng)組織繼發(fā)性損傷降低，減少病人神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。而在之前的研究中，有報(bào)道使用自組裝短肽溶液可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同組織中完成快速止血的現(xiàn)象，完全止血時(shí)間小于20 s［1］。該過程未借助壓力，烙燒，血管收縮，凝結(jié)和交聯(lián)附著物（cross-linked adhesives）等傳統(tǒng)的外科止血方法［2-4］。這種快速止血效果對神經(jīng)外科手術(shù)中減少流血對神經(jīng)組織的損傷以及野外急救有著極其重要的意義。并且，已有實(shí)驗(yàn)證明該短肽溶液可以減少中樞神經(jīng)組織急性創(chuàng)傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡（TUNEL法）［5］。

在本研究中，自組裝短肽RADA16-1自組裝形成的長纖維首先通過超聲處理破壞，通過圓二色譜儀、原子力顯微鏡和流變儀研究了自組裝短肽RADA16-1在水溶液中的自組裝動(dòng)力學(xué)特征。同時(shí)，以SD大鼠脊髓全橫斷（T8）和肝臟橫切作為創(chuàng)傷出血模型，統(tǒng)計(jì)短肽溶液的止血時(shí)間，分析短肽纖維長度及形成的水凝膠的黏度與止血時(shí)間的相關(guān)性。該研究可對了解短肽自組裝過程和自組裝短肽止血機(jī)理，完善RADA16-1的止血應(yīng)用開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 短肽樣品制備

短肽RADA16-1分子式為RADARADA?RADARADA（RADA16-1），由上海波肽多肽合成實(shí)驗(yàn)室合成和純化（該多肽分子量為1712 ku，純度大于95%）。實(shí)驗(yàn)前短肽RADA16-1用去離子水溶解至終濃度1%，再經(jīng)超聲處理1 min后用0.22 μm的濾膜過濾，無菌分裝室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 圓二色譜（CD）檢測樣品的準(zhǔn)備

將合成的短肽RADA16-1稀釋至終濃度為90 μmol/L（0.15 mg/mL）的肽溶液作為 CD 測試液。光譜掃描范圍190～260 nm，掃描速度10 nm/3 s，所得數(shù)據(jù)用OriginPro 7.0作出譜線。圓二色譜使用的CD儀為AVIV MODEL 400。

1.3 原子力顯微鏡掃描及自組裝分析

使用日本精工SPA400型原子力顯微鏡掃描云母表面上樣品，為DFM模式。所用探針為硅探針，型號(hào)是SI-DF20，懸臂長度是200 μm，工作頻率是127 kHz，彈性系數(shù)是12 N/m。掃描采用的分辨率為512×512像素的表面形貌圖和相圖。掃描參數(shù)設(shè)置如下：頻率≈123 kHz，嚙合前抖動(dòng)振幅≈1V，積分增益0.1～0.3，比例增益0.02～0.1，掃描速度1～2 Hz。

在新揭開的云母表面滴5 μL短肽溶液，15 s后用100 μL去離子水沖洗3次，室溫晾干。取樣點(diǎn)分別是超聲處理前，超聲后2、30、120、240、1440 min。樣品表征后應(yīng)用離線軟件隨機(jī)測量每個(gè)取樣點(diǎn)圖中15根纖維的長度，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)纖維的平均長度。

1.4 材料流變學(xué)分析

樣品黏彈性使用流變儀進(jìn)行測定（AR2000，TA Instruments），取200 μL短肽溶液樣品放置在流變儀托盤上，使用脂真空密封。在1 Hz恒定頻率時(shí)測量水凝膠儲(chǔ)能模量（G′），測試時(shí)間為1 min。取樣時(shí)間點(diǎn)同原子力顯微鏡表征。

1.5 脊髓損傷止血?jiǎng)游锬Ｐ?/h3>

成年SD大鼠，鼠齡17～32天，雌雄不限，由江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。該中心獲得湖北省科學(xué)技術(shù)廳頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證》（許可證號(hào)：syxk（鄂）2012-0042，有效期為2012.3.5-2017.3.4）實(shí)驗(yàn)經(jīng)過江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，盡可能減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛苦及使用數(shù)量。用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，于手術(shù)顯微鏡下在大鼠胸椎T8～T10的位置背側(cè)椎板切除暴露對應(yīng)段位脊髓，使用眼科手術(shù)刀對脊髓T8進(jìn)行全橫斷，切斷后迅速將1%的不同時(shí)間點(diǎn)自組裝短肽溶液50 μL注射入創(chuàng)口，用于創(chuàng)口出血控制，記錄完全止血時(shí)間?？瞻讓φ战M以生理鹽水處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每組6只（n=6），實(shí)驗(yàn)組分為：空白對照組，超聲處理前，超聲后2、30、120、240、1440 min組。

1.6 肝創(chuàng)傷止血?jiǎng)游锬Ｐ?/h3>

成年SD大鼠，以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部去毛備皮，10號(hào)手術(shù)刀切開老鼠腹部，暴露肝臟。使用15號(hào)手術(shù)刀在最大一葉肝臟切開1 cm長深0.5 cm切口。迅速將1%的不同時(shí)間點(diǎn)自組裝短肽溶液200 μL注射入創(chuàng)口，用于創(chuàng)口出血控制，記錄止血時(shí)間。空白對照組以生理鹽水處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每組6只（n=6），實(shí)驗(yàn)組分為：空白對照組，超聲處理前，超聲后2、30、120、240、1440 min組。

2 結(jié)果

2.1 圓二色譜分析

圓二色譜結(jié)果顯示，超聲前后短肽RA?DA16-1均為明顯的β-折疊構(gòu)象（圖1），提示超聲處理未改變短肽單體分子內(nèi)構(gòu)象，且超聲后β-折疊特征峰（216 nm）的輕微變高顯示更密集的β-折疊聚集，說明超聲處理未破壞短肽RADA16-1單體分子結(jié)構(gòu)。

圖1 自組裝短肽RADA16-1超聲處理前后的圓二色譜（CD）

2.2 自組裝短肽的自組裝過程原子力表征

原子力顯微鏡表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，結(jié)果表明RADA16-1可以自組裝成長度約（786.34±96.54）nm的長纖維（圖2A）。為研究納米纖維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，RADA16-1水凝膠使用超聲處理1 min，以破壞長纖維。原子力顯微鏡表征顯示，超聲后2 min短肽RADA16-1自組裝形成的長纖維被折斷成平均長度（21.22±5.45）nm的短纖維（圖2B）。隨超聲處理后時(shí)間的增加，這些折斷的短纖維具有自組裝能力，最終自組裝成長度約（615.4±103.54）nm的長纖維（圖2F：超聲處理后1440 min）。以上超聲處理后原子力顯微鏡表征實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，3次實(shí)驗(yàn)均得到近似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，折斷的短纖維具有自組裝成長纖維的能力，且該過程可重復(fù)。

圖2 超聲處理前后自組裝短肽RADA16-1的原子力顯微鏡表征圖

2.3 流變力學(xué)分析

該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。每次實(shí)驗(yàn)中，均可觀察到水凝膠儲(chǔ)能模量（G′）從超聲后2 min的6 Pa上升到超聲后240 min的36.5 Pa，且超聲后1440 min時(shí)間點(diǎn)水凝膠的儲(chǔ)能模量（G′）達(dá)到50 Pa，結(jié)果見圖3。

圖3 流變力學(xué)分析結(jié)果

RADA16-1動(dòng)態(tài)自組裝的纖維長度變化和RADA16-1形成的多肽水凝膠的儲(chǔ)能模量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，自組裝纖維長度和水凝膠儲(chǔ)能模量相關(guān)（P＜0.05）。

2.4 脊髓創(chuàng)傷與肝臟創(chuàng)傷止血實(shí)驗(yàn)

椎板切除后，在胸段T8的位置使用眼科手術(shù)刀對脊髓進(jìn)行全橫斷，將超聲前以及超聲后不同時(shí)間點(diǎn)的50 μL 1%濃度短肽RADA16-1水凝膠滴注進(jìn)創(chuàng)口，記錄止血時(shí)間。超聲前和超聲后1440 min水凝膠樣本可以在20 s內(nèi)完成止血。而對照的生理鹽水組和超聲后2 min實(shí)驗(yàn)組，完全止血時(shí)間大于180 s。在肝臟左葉橫切后，使用200 μL 1%濃度的不同時(shí)間點(diǎn)水凝膠滴注進(jìn)創(chuàng)口。超聲前和超聲后1440 min實(shí)驗(yàn)組均在20 s內(nèi)完成止血。而對照的生理鹽水組和超聲后2 min實(shí)驗(yàn)組，完全止血時(shí)間大于300 s，結(jié)果見圖4。

圖4 短肽材料止血效果分析

3 討論

已知短肽RADA16-1在水溶液中呈穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu)，β-折疊是RADA16-1能夠自組裝的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。超聲前后的CD檢測顯示溶液中短肽為明顯的β-折疊特征，即短肽RADA16-1的結(jié)構(gòu)未因超聲發(fā)生改變［6］，同時(shí)分析CD結(jié)果，發(fā)現(xiàn)超聲后溶液中存在β-折疊聚集的現(xiàn)象，該結(jié)果與Yokoi等［4］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，分析原因可能是溶液中RADA16-1單體和超聲折斷的自組裝長纖維通過非共價(jià)鍵的自發(fā)聚集行為［7］。

原子力顯微鏡掃描分析顯示自組裝短肽RA?DA16-1形成的納米纖維長度由幾百納米到幾微米之間。超聲后纖維斷裂成長度小于50 nm的短纖維。短纖維重組裝的動(dòng)力學(xué)在超聲后2、30、120、240、1440min被測定。結(jié)果顯示，纖維的重組裝表現(xiàn)出時(shí)間相關(guān)性：到24 h，重組裝形成的纖維長度與原有纖維長度近似，長度（615.4±103.54）nm。重組裝過程中，組裝速度表現(xiàn)出的呈時(shí)間相關(guān)的先快后慢的特征，可能是由于超聲后產(chǎn)生的短纖維的濃度效應(yīng)［8］。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，重組裝纖維長度的增加與水凝膠流變學(xué)特征的改變呈對應(yīng)關(guān)系。儲(chǔ)能模量隨超聲后時(shí)間的增加達(dá)到最后G′＞45，相對應(yīng)的自組裝纖維長度達(dá)到600 nm，即纖維越長，水凝膠的儲(chǔ)能膜量G′越高。論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

短肽RADA16-1的完全止血可以在約20 s完成，該過程不同于傳統(tǒng)的止血方式。通過研究短肽RADA16-1的自組裝動(dòng)力學(xué)過程和分析止血實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)短肽自組裝成的纖維長度越長，其止血時(shí)間越短，可以將短肽RADA16-1溶液止血的機(jī)制歸納如下：①超聲將RADA16-1自組裝形成的長纖維打斷成短纖維，而超聲后不同時(shí)間點(diǎn)的RADA16-1溶液止血所消耗的時(shí)間隨著纖維自組裝增長而縮短。到1440 min止血平均時(shí)間約20 s，已經(jīng)接近超聲前RADA16-1完成止血需要的平均時(shí)間。②長纖維為水凝膠提供了較高的儲(chǔ)能膜量，使水凝膠更能耐受血液脈搏的壓力［9］。對止血過程進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，超聲后早期時(shí)間點(diǎn)短纖維止血耗時(shí)長，水凝膠的儲(chǔ)能模量低，膠體易碎，會(huì)出現(xiàn)血液沖破水凝膠而導(dǎo)致止血失敗的情況。而超聲后1440 min和超聲前的RA?DA16-1在創(chuàng)口內(nèi)形成的水凝膠，均表現(xiàn)出一定的彈性，膠體可隨脈搏出現(xiàn)波動(dòng)，但無血液沖破水凝膠的情況發(fā)生。③短肽RADA16-1單體含精氨酸和谷氨酸殘基，使短肽自組裝形成的纖維帶電荷，帶電荷的纖維可通過靜電作用與創(chuàng)口很好地黏合［10］。

本實(shí)驗(yàn)對短肽RADA16-1自組裝成長纖維的時(shí)間動(dòng)力學(xué)變化特點(diǎn)及其與止血功能之間的關(guān)系的研究，有助于更好地理解該型短肽的物理化學(xué)特點(diǎn)，為完善RADA16-1的止血應(yīng)用開發(fā)提供理

［1］Ellis-Behnke R G，Liang Y X，Tay D K C，et al.Nano hemostat solution：immediate hemostasis at the na?noscale［J］.Nanomedicine：nanotechnology，biology，and medicine，2006，2（4）：207-215.

［2］Schonauer C，Tessitore E，Barabagallo G，et al.The use of local agents：bone wax，gelatin，collagen，oxi?dized cellulose［J］.European Spine Journal，2004，13（Suppl 1）：S89-S96.

［3］Sabel M，Stummer W.The use of local agents：surgicel and surgifoam［J］.European Spine Journal，2004，13（Suppl）：S97-S101.

［4］Yokoi H，Kinoshita T，Zhang S.Dynamic reassembly of peptide RADA16 nanofiber scaffold［J］.Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America，2005，120（24）：8414-8419.

［5］呂斐，王松濤，王婷，等.自組裝短肽在脊髓急性創(chuàng)傷早期減少細(xì)胞凋亡的研究［J］.四川動(dòng)物，2010，29（2）：180-183.

［6］Ruan L，Zhang H，Luo H，et al.Designed amphiphilic peptide forms stable nanoweb，slowly releases encapsu?lated hydrophobic drug，and accelerates animal hemo?stasis［J］.Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（13）：5105-5110.

［7］孫麗娟，趙曉軍.氨基酸序列和時(shí)間對短肽納米纖維形成的影響［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2009，26（6）：1276-1280.

［8］Oh S H，Park S C，Kim H K，et al.Degradation behav?ior of 3D porous polydioxanone-β-polycaprolactone scaffolds fabricated using the melt-molding particu?late-leaching method［J］.J Biomater Sci Polym Ed，2011，22：225-237.

［9］Srouji S，Kizhner T，Suss-Tobi E，et al.3-D nanofi?brous electrospun multilayered construct is an alterna?tive ECM mimicking scaffold［J］.J Mater Sci：Mater Med，2008，19：1249-1255.

［10］Richette P，Ravaud P，Conrozier T，et al.Effect of hy?aluronic acid in symptomatic hip osteoarthritis：a multi?center，randomized，placebo-controlled trial［J］.Ar?thritis Rheum，2009，60（3）：824-830.