姚飛 陳繼冰 袁遠(yuǎn)英 曾健瀅 王小花 劉衛(wèi)群 李家亮 穆峰 牛立志 左建生 徐克成

·短篇論著·

冷凍消融聯(lián)合DC-CIK治療伴轉(zhuǎn)移的胰腺癌

姚飛 陳繼冰 袁遠(yuǎn)英 曾健瀅 王小花 劉衛(wèi)群 李家亮 穆峰 牛立志 左建生 徐克成

對(duì)于伴有轉(zhuǎn)移的晚期胰腺癌，因腫瘤對(duì)放、化療治療不敏感，且不良反應(yīng)較大，治療后患者生存時(shí)間有限[1]。有研究顯示，氬氦刀冷凍聯(lián)合碘離子植入治療Ⅳ期胰腺癌術(shù)后患者不良反應(yīng)少，耐受性好，中位生存時(shí)間為8個(gè)月[2]，同時(shí)氬氦刀冷凍治療還可緩解腫瘤侵襲神經(jīng)引起的劇烈疼痛，提高患者的生存質(zhì)量[3]。自體腫瘤抗原負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞聯(lián)合自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(DC-CIK)的免疫治療可在不損傷機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下直接殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、改善患者生存質(zhì)量具有重要意義[4-5]。本研究回顧性分析化療、DC-CIK、氬氦刀冷凍消融以及冷凍聯(lián)合DC-CIK4種治療方式對(duì)伴轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者生存時(shí)間的影響。

一、材料與方法

1．臨床資料：2008年11月至2011年6月廣州復(fù)大腫瘤醫(yī)院共收治145例經(jīng)病理確診的Ⅳ期胰腺癌患者。入組條件：(1)治療前卡氏評(píng)分(karnofsky performance status，KPS)≥70；(2)血小板計(jì)數(shù)≥80×109/L，白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥3×109/L，嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥2×109/L，血紅蛋白含量≥90 g/L；(3)前凝血酶國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值≥1.5；(4)術(shù)前CT評(píng)價(jià)最大原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶長(zhǎng)徑<6 cm；(5)胰腺腫瘤未浸潤(rùn)總膽管、后腔靜脈、十二指腸或結(jié)腸；(6)無(wú)3級(jí)高血壓、嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈疾病、骨髓移植、呼吸系統(tǒng)疾病以及急慢性感染；(7)肝功能基本正常、腹水穿刺釋放量<1 L；(8)患者愿意且可配合完成治療過(guò)程；(9)臨床與隨訪資料完整；(10)簽署知情同意書(shū)。入組胰腺癌患者共106例，其中男性57例，女性49例，中位年齡65歲(42～84歲)。55例次患者伴肝轉(zhuǎn)移，35例次患者伴腹膜及肝轉(zhuǎn)移，26例次患者存在其他部位轉(zhuǎn)移。26例患者存在糖尿病，25例患者存在胸腹水，14例患者存在輕度高血壓。經(jīng)綜合評(píng)估后，36例患者接受單純胰腺及轉(zhuǎn)移瘤的冷凍消融，31例患者冷凍消融后再接受DC-CIK治療，22例患者接受單純化療，17患者接受單純DC-CIK治療。

2．經(jīng)皮冷凍消融術(shù)：參考文獻(xiàn)[6]的方法。

3．DC-CIK治療：取患者外周血單核細(xì)胞，加入細(xì)胞因子定向誘導(dǎo)成CIK和DC，用自體腫瘤抗原(Ag)在培養(yǎng)的第5天負(fù)載DC，第8天將DC與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)。待DC-CIK細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1.0×1010～1.3×1010時(shí)開(kāi)始回輸?；剌斍跋褥o脈滴注生理鹽水，然后連接含1%人白蛋白的生理鹽水200 ml制成的細(xì)胞懸液回輸細(xì)胞，1 h內(nèi)輸完，隔天1次，共5次，每療程回輸細(xì)胞總數(shù)>5×109。

4．化療：每次靜脈注射吉西他濱，1周2次，持續(xù)3周，暫停一周，每例患者平均接受6個(gè)周期治療。

5．冷凍聯(lián)合DC-CIK治療：在冷凍消融前2 d取血培養(yǎng)CIK及DC后再回輸。

6．免疫功能評(píng)價(jià)：采用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)患者外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能。采用TBNK試劑(no. 644611，BD) 檢測(cè) CD3+CD4+細(xì)胞(參考值：441～2156細(xì)胞數(shù)/μl)、CD3+CD8+(參考值：125～1312細(xì)胞數(shù)/μl)、CD3+(參考值：603～2990細(xì)胞數(shù)/μl)、CD3-CD19+(參考值：107～698細(xì)胞數(shù)/μl)和CD3-CD16+CD56+(參考值：95/μl～640細(xì)胞數(shù)/μl)細(xì)胞數(shù)。采用Human Th1/Th2 Cytokine Kit II (no.551809，BD)檢測(cè) IL-2(參考值：8～12.5 pg/ml)、IL-4(參考值：3.5～6 pg/ml)、IL-6(參考值：2.7～8.5 pg/ml)、IL-10(參考值：1.8～4 pg/ml)、TNF(參考值：1.7～2.5 pg/ml)和IFN-γ(參考值：1.5～4 pg/ml)水平。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

7．術(shù)后評(píng)估和隨訪：根據(jù)《通用手術(shù)副作用術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)4.0版》對(duì)不良事件嚴(yán)重度從1～5級(jí)的臨床描述對(duì)術(shù)后不良反應(yīng)進(jìn)行記錄、分級(jí)和評(píng)價(jià)。術(shù)后腹部CT平掃評(píng)估冷凍引起的并發(fā)癥。術(shù)后第1個(gè)月及間隔3個(gè)月進(jìn)行一次CT平掃評(píng)價(jià)冷凍效果。通過(guò)修正的《實(shí)體腫瘤應(yīng)答評(píng)估原則v1.1》 評(píng)估胸腔和腹腔腫瘤應(yīng)答情況。隨訪記錄包括術(shù)后患者病情及生存情況。

8．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用美國(guó)San Diego公司GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理?；颊呱嫫趶拇_診日算起。冷凍前后免疫指標(biāo)變化采用t檢驗(yàn)。生存率曲線采用Kaplan-Meier方法描繪，各治療組間患者總體生存期差異采用Dunnett test或Tukey-Kramer test，冷凍次數(shù)、治療前患者免疫功能與患者總體生存期關(guān)系采用Long-rank檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1．冷凍消融術(shù)后不良反應(yīng)：冷凍消融術(shù)后均未出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。19例(28%)患者于術(shù)后1 d出現(xiàn)血清淀粉酶升高，術(shù)后5 d恢復(fù)正常；7例(10%)糖尿病患者術(shù)后1 d空腹血糖上升至20～25 mmol/L；12例患者(18%)術(shù)后出現(xiàn)輕微血小板下降，均于術(shù)后8～13 d自動(dòng)恢復(fù)；21例(31%)患者腹脹或腹部疼痛，術(shù)后5 d內(nèi)消失；17例(25%)患者術(shù)后出現(xiàn)食欲減退、腹腔積液，術(shù)后3～5 d緩解；14例(21%)患者出現(xiàn)腹部輕微出血，于術(shù)后7 d緩解；19例患者體溫升高，其中冷凍聯(lián)合DC-CIK治療組11例，冷凍治療組2例，DC-CIK治療組6例，但發(fā)熱均不超過(guò)39 °C。均于治療后3 d恢復(fù)。

2．免疫功能變化：冷凍聯(lián)合DC-CIK治療組患者及單純DC-CIK治療組患者血淋巴細(xì)胞數(shù)量及反應(yīng)淋巴細(xì)胞功能的細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 胰腺癌患者免疫功能測(cè)定

3．治療方式與患者生存期關(guān)系：全組患者總體中位生存期為7個(gè)月，其中冷凍聯(lián)合DC-CIK治療組的中位生存期為13個(gè)月，冷凍治療組為7個(gè)月，DC-CIK治療組為5個(gè)月，化療組為3.5個(gè)月。冷凍聯(lián)合DC-CIK治療組患者總體生存期顯著長(zhǎng)于冷凍組(P<0.05)，冷凍組的總體生存期又顯著長(zhǎng)于化療組(P<0.001)。

4．冷凍消融次數(shù)與患者生存期關(guān)系：冷凍聯(lián)合DC-CIK治療組中12例患者(2次：8例；3次：4例；4次：1例；9次：1例)，冷凍治療組中15例患者(2次：9例；3次：6例)接受多次冷凍治療，接受多次冷凍治療患者的總體生存期顯著長(zhǎng)于同組接受單次冷凍治療的患者(P值分別為0.0048、0.041，圖1)。冷凍治療組中單次冷凍患者的中位生存期為7個(gè)月，多次冷凍患者的中位生存期為9個(gè)月。

圖1冷凍聯(lián)合DC-CIK治療組(a)、冷凍治療組(b)的冷凍消融次數(shù)與患者總體生存期的相關(guān)性

5．治療前免疫水平與患者生存期關(guān)系：冷凍聯(lián)合DC-CIK治療組中21例患者免疫指標(biāo)高于或處于參考范圍內(nèi)，10例低于參考范圍；DC-CIK治療組中10例高于或處于參考范圍內(nèi)，7例低于參考范圍。免疫指標(biāo)高于或處于參考范圍患者的總體生存期均顯著長(zhǎng)于同組免疫指標(biāo)低于參考范圍患者，冷凍聯(lián)合DC-CIK治療組為14個(gè)月比7.5個(gè)月，DC-CIK治療組為6個(gè)月比2個(gè)月(P值均≤0.001, 圖2)。

圖2冷凍聯(lián)合DC-CIK治療組(a)、DC-CIK治療組(b)患者免疫功能與總體生存期的相關(guān)性

討論對(duì)于伴轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者，由于失去手術(shù)機(jī)會(huì)，其治療方法有限。目前一線治療方案是化療，但吉西他濱化療患者的生存期延長(zhǎng)有限，聯(lián)合化療方案FOLFIRINOX可使患者中位生存期延長(zhǎng)到11.1個(gè)月[7]。本研究中單純吉西他濱化療組患者的中位生存期僅3.5個(gè)月。

DC-CIK免疫治療一直是免疫治療領(lǐng)域非常重要的腫瘤治療方法[8-9]。DC是有效的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，成熟的DC可以通過(guò)Ⅱ型組織相容性抗原(MHC-Ⅱ)等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)是一類(lèi)抗腫瘤抗病毒效應(yīng)細(xì)胞，能在體外被誘導(dǎo)并大量增殖。兩者結(jié)合可有效殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，DC-CIK治療患者的中位生存期為5個(gè)月，并不能顯著延長(zhǎng)生存時(shí)間。其原因可能是由于腫瘤局部的微環(huán)境對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用[10]。因?yàn)樵谀[瘤局部微環(huán)境中DC的抗原提呈功能缺失或者受損，DC也可能處于免疫抑制狀態(tài)或者產(chǎn)生免疫耐受，從而限制了效應(yīng)T細(xì)胞的功能。因此，在免疫治療的同時(shí)應(yīng)該盡可能地對(duì)腫瘤進(jìn)行消融治療，改變腫瘤微環(huán)境[11-12]。本研究中冷凍聯(lián)合DC-CIK免疫治療伴轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者的中位生存時(shí)間為13個(gè)月，顯著高于單純免疫治療、單純冷凍治療及單純吉西他濱化療的患者。這是因?yàn)槔鋬鲋委熓窃谀[瘤原位對(duì)腫瘤組織進(jìn)行冷消融，腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡后會(huì)釋放大量的腫瘤相關(guān)抗原入血，從而誘發(fā)冷凍免疫反應(yīng)[11，13]，同時(shí)也使DC攜帶更多的腫瘤抗原信號(hào)，從而更加精準(zhǔn)地殺傷腫瘤；冷凍消融還可解除腫瘤局部微環(huán)境對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用，提高免疫治療療效；免疫治療可殺滅轉(zhuǎn)移的腫瘤灶，減少腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此，冷凍聯(lián)合DC-CIK治療可最大限度地減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)患者的生存期，這可能是伴轉(zhuǎn)移的胰腺癌治療領(lǐng)域的一條新路。

本次研究對(duì)冷凍治療次數(shù)、患者免疫功能與生存時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示，接受多次治療患者總體生存期優(yōu)于單次冷凍治療患者，治療前免疫功能正?；颊呖傮w生存期顯著長(zhǎng)于治療前免疫功能異?；颊?，提示多次冷凍可進(jìn)一步延長(zhǎng)患者的生存期，而患者的總體生存期與患者的機(jī)體免疫功能有關(guān)。

[1] Burris HA, Moore MJ, Andersen J, et al. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial. J Clin Oncol,1997, 15:2403-2413.

[2] Chen JB, Li JL, He LH, et al. Radical treatment of stage IV pancreatic cancer by the combination of cryosurgery and iodine-125 seed implantation. World J Gastroenterol,2012, 18:7056-7062.

[3] Niu L, Wang Y, Yao F, et al. Alleviating visceral cancer pain in patients with pancreatic cancer using cryoablation and celiac plexus block. Cryobiology,2013, 66:105-111.

[4] Su X, Zhang L, Jin L, et al. Coculturing dendritic cells with zoledronate acid efficiently enhance the anti-tumor effects of cytokine-induced killer cells. J Clin Immunol,2010, 30:766-774.

[5] Marten A, Renoth S, von Lilienfeld-Toal M, et al. Enhanced lytic activity of cytokine-induced killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic cells. Haematologica,2001, 86:1029-1037.

[6] Xu KC, Niu LZ, Hu YZ, et al. Cryosurgery with combination of (125)iodine seed implantation for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. J Dig Dis,2008, 9:32-40.

[7] Tokh M, Bathini V，Saif MW. First-line treatment of metastatic pancreatic cancer. JOP,2012, 13:159-162.

[8] Li XD, Xu B, Wu J, et al. Review of Chinese clinical trials on CIK cell treatment for malignancies. Clin Transl Oncol,2012, 14:102-108.

[9] Thanendrarajan S, Nowak M, Abken H, et al. Combining cytokine-induced killer cells with vaccination in cancer immunotherapy: more than one plus one? Leuk Res,2011, 35:1136-1142.

[10] Plate J. Clinical trials of vaccines for immunotherapy in pancreatic cancer. Expert Rev Vaccines,2011, 10:825-836.

[11] Sabel MS. Cryo-immunology: a review of the literature and proposed mechanisms for stimulatory versus suppressive immune responses. Cryobiology,2009, 58:1-11.

[12] Schnurr M, Scholz C, Rothenfusser S, et al. Apoptotic pancreatic tumor cells are superior to cell lysates in promoting cross-priming of cytotoxic T cells and activate NK and gammadelta T cells. Cancer Res,2002, 62:2347-2352.

[13] Rovere-Querini P, Manfredi AA. Tumor destruction and in situ delivery of antigen presenting cells promote anti-neoplastic immune responses: implications for the immunotherapy of pancreatic cancer. JOP,2004, 5:308-314.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.05.015

510665 廣州，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州復(fù)大腫瘤醫(yī)院(姚飛、陳繼冰、曾健瀅、王小花、劉衛(wèi)群、李家亮、牛立志、左建生、徐克成)；中國(guó)科學(xué)院廣州復(fù)大生物院附屬?gòu)?fù)大醫(yī)院(袁遠(yuǎn)英、穆峰)

李家亮, Email:feyamail@163.com

2013-05-03)

(本文編輯：呂芳萍)