楊 琨 董 武 榮 陽 趙艷敏 高笑天 汪 明 張 月 劉瑞雪

1.遼寧省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學(xué)遼陽中心醫(yī)院放射科，遼寧遼陽 111000；3.上海柯萊遜生物技術(shù)有限公司，上海 201201；4.遼寧省人民醫(yī)院消化二科，遼寧沈陽 110016

惡性腫瘤在我國居民疾病致死原因中位列第三，其中肺癌的致死率逐年上升。最近的研究數(shù)據(jù)顯示，肺癌已經(jīng)超過胃癌，成為所有癌癥中每年致死人數(shù)最多的腫瘤[1]。目前腫瘤主要的治療方法為外科手術(shù)切除，化療、放療。但腫瘤患者經(jīng)過手術(shù)、常規(guī)化療、放療達(dá)到臨床治愈后，體內(nèi)仍殘留腫瘤細(xì)胞，停止治療后，殘留的腫瘤細(xì)胞又開始增殖，經(jīng)若干時(shí)間后會(huì)達(dá)到109個(gè)細(xì)胞，出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)，這是治療失敗的主要原因之一。生物免疫治療作為新的治療方法最近得到了廣泛的關(guān)注，其具有靶向殺傷、特異性高、不良反應(yīng)小以及可以殺傷對(duì)化療耐藥的腫瘤細(xì)胞等優(yōu)勢(shì)[2-3]。目前在國內(nèi)、外得到廣泛應(yīng)用的免疫細(xì)胞治療是樹突狀細(xì)胞（dendritc cell，DC）和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cells，CIK）兩種細(xì)胞聯(lián)合治療腫瘤，但傳統(tǒng)治療理念認(rèn)為化療藥物可以殺死免疫細(xì)胞，所以生物免疫治療經(jīng)常在化療間歇期進(jìn)行，筆者查閱了一些國外的文獻(xiàn)，認(rèn)為只要掌握好化療藥物的劑量，在化療期間也可應(yīng)用免疫細(xì)胞治療，本實(shí)驗(yàn)通過體外和體內(nèi)兩種途徑，探究化療藥物紫杉醇對(duì)免疫細(xì)胞DC、CIK生物活性的影響和對(duì)抑制腫瘤能力的調(diào)控，為化療期間同時(shí)應(yīng)用免疫細(xì)胞治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤細(xì)胞株 肺癌A549細(xì)胞株來源于中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，由遼寧省人民醫(yī)院生物治療中心實(shí)驗(yàn)室體外傳代培養(yǎng)。

1.1.2 藥品及試劑 基因重組人IL-2（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司）、抗-CD3單抗（CD3McAb）、淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll Paque Plus公司）、Triton X-100（德國Applichem公司）、基因重組人IFN-γ（上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、RPMI Medium 1640培養(yǎng)基（美國 GIBCO）、胎牛血清（美國 GIBCO）、PBS緩沖液、紫杉醇注射液、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀、24及96孔板、復(fù)方枸櫞酸鈉保存液、流式細(xì)胞檢測(cè)抗體 anti-CD86-FITC、anti-CD40-PE、anti-MHCⅡ-PE、anti-IL-12-PE均來自 BD公司。LDH ELISA試劑盒。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只SPF級(jí)BALB/C裸鼠，購于北京華阜康科技股份有限公司，（許可證號(hào)：SCXK （京）2009-004），由沈陽中海生物技術(shù)開發(fā)有限公司動(dòng)物中心飼養(yǎng)，雌性，鼠齡 6～8 周，體重 18～22 g。

1.2 方法

1.2.1 凍融法制備肺癌A549細(xì)胞抗原 消化收集對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用PBS液離心洗滌兩次，再用PBS液重懸為1×1010個(gè)/L，封裝入凍存管。置-80℃冰箱冷凍 10 min，重復(fù) 3次，然后，以 10 000 r/min離心30 min，取上清液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DC細(xì)胞誘導(dǎo)、擴(kuò)增 機(jī)采健康人外周血35 mL，用Ficoll密度梯度離心，分離單個(gè)核細(xì)胞。用PBS洗滌2次并計(jì)數(shù)。離心并將細(xì)胞重懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。收集非黏附性細(xì)胞于50 mL離心管中，用于誘導(dǎo)CIK細(xì)胞。在留有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入含有1000 U/mL rhGM-CSF和1000 U/mL rhIL-4的10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液100 mL，分5組培養(yǎng)，分別在紫杉醇 5 ng/mL（b 組）、10 ng/mL（c 組）、20 ng/mL（d 組）、40 ng/mL（e組）的濃度下及不加紫杉醇的條件下（a組）培養(yǎng)DC細(xì)胞，每3天半量換液，同時(shí)補(bǔ)足上述rhGM-CSF及 rhIL-4， 置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于DC培養(yǎng)第 5天加入10 μL/mL肺癌 A549細(xì)胞凍融抗原，第6天加入1000 U/mL腫瘤壞死因子，分別收集培養(yǎng)第7天的各組DC細(xì)胞，檢測(cè)各組DC細(xì)胞的存活率，并用于其他實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 各組DC細(xì)胞表型、細(xì)胞因子檢測(cè) 各組DC細(xì)胞上清培養(yǎng)液用于IL-12的流式細(xì)胞檢驗(yàn)。沉淀的細(xì)胞用 FACS 緩沖溶液（HBSS，2%FBS，0.05%NaAzide）洗滌，并用含有符合流式儀器要求的anti-CD86-PE、anti-CD40-PE、anti-MHCⅡ-PE抗體的 FACS重懸浮，在4℃下培養(yǎng)30 min。用FACS緩沖溶液洗滌兩遍，用流式細(xì)胞儀分析，所得數(shù)據(jù)用FACSDiva軟件分析（美國BD公司）。

1.2.4 CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增 將上述誘導(dǎo)DC時(shí)收集的非貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，用于CIK 細(xì)胞培養(yǎng)。 當(dāng)天加入 IFN-γ（1000 U/mL），24 h后加入 CD3 單抗 （50 ng/mL）、IL-2 （300 U/mL）、IL-1α（100 U/mL），置于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，第 3 天以后視培養(yǎng)情況補(bǔ)液或傳代，連續(xù)培養(yǎng)14 d，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 裸鼠肺癌腫瘤模型的建立 收集對(duì)數(shù)生長期的A549人肺癌細(xì)胞，離心棄上清，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×107/mL，取混勻的細(xì)胞懸液接種于裸鼠右側(cè)腋下皮下，待腫瘤體積達(dá)到 500 mm3以上時(shí)，將腫瘤切成2 mm×1 mm×1 mm大小的瘤塊，接種于新購裸鼠右側(cè)腋下皮下，體內(nèi)傳3代后進(jìn)行分組給藥。

1.2.6 乳酸脫氫酶釋放法（LDH）測(cè)定DC抗原傳遞能力 按文獻(xiàn)[14]所建立的方法進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。取A549肺癌細(xì)胞株處于生長對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×105/mL作為靶細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。4 h后分別取紫杉醇處理 的DC（c組）和正常培養(yǎng)的DC細(xì)胞 （a組）5×105/mL與培養(yǎng)第 14天的CIK細(xì)胞1×107/mL共培養(yǎng)3 d作為效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)：分別按照效靶比5、10、20（效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量按照1×107/mL計(jì)算）將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混合，500 r/min離心5 min，共同孵育于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱 6 h之后，離心1500 r/min離心10 min，取上清按照試劑盒說明在用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光值，計(jì)算殺傷活性：殺傷活性（%）=[（實(shí)驗(yàn)組 A值-總自然釋放 A值）/（最大釋放組A值-總自然釋放A值）]×100%?？傋匀会尫臕值=靶細(xì)胞自然釋放A值+效應(yīng)細(xì)胞自然釋放A值。

1.2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組給藥及檢測(cè)指標(biāo) 按照上述方法建立裸鼠肺癌模型，2 d后將30只裸鼠隨機(jī)分成5組，分別為A組（對(duì)照組）：細(xì)胞株A549+鹽水（NS）；B組：細(xì)胞株 A549+DC+CIK；C組：細(xì)胞株 A549+CIK+TAX；D組：細(xì)胞株A549+TAX；E組：細(xì)胞株A549+TAX+DC+CIK。各組具體用藥情況見表1。每3天檢測(cè)1次腫瘤大小，裸鼠存活時(shí)間，紫杉醇（TAX）按每只裸鼠20 mg/kg腹腔注射，CIK細(xì)胞為培養(yǎng) 14 d之后的成熟細(xì)胞，DC細(xì)胞按文中方法培養(yǎng)并激活，將各組細(xì)胞配成1×107/0.2 mL，尾部靜脈注射連續(xù) 5 d，NS為生理鹽水對(duì)照。瘤體積（V）=0.5×長徑×短徑的平方，計(jì)算每組裸鼠平均存活時(shí)間。

表1 各組用藥情況

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)所收集數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇對(duì)于細(xì)胞存活率的影響

在共培養(yǎng)6 d的前提下，b、c組第 6天存活率與第0天存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明DC細(xì)胞對(duì)于10 ng/mL以下的紫杉醇具有較好的耐受能力。濃度在10 ng/mL以上的紫杉醇會(huì)顯著降低DC細(xì)胞的存活率，d、e組第 6天存活率與第 0天存活率比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其中與濃度40 ng/mL的紫杉醇共培養(yǎng)6 d的DC細(xì)胞，存活率僅為17.5%。見圖1。

圖1 不同濃度的紫杉醇對(duì)DC細(xì)胞生存率的影響

2.2 紫杉醇對(duì)于細(xì)胞生物活性的影響

c組和e組CD86、CD40、MHCⅡ的表達(dá)以及IL-12的分泌與正常組相比有顯著增加（P＜0.05）。d組除了CD86，其他檢測(cè)指標(biāo)較正常組均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。b組中只有MHCⅡ較正常組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明低濃度紫杉醇（5 ng/mL）通過上調(diào)MHCⅡ的表達(dá)增強(qiáng)DC細(xì)胞抗原呈遞的能力。中濃度紫杉醇（10 ng/mL） 可以上調(diào) DC細(xì)胞上的 CD86、CD40和MHCⅡ的表達(dá)以及促進(jìn)其IL-12的分泌，從而促進(jìn)DC成熟并增強(qiáng)其抗原呈遞能力。然而在高濃度下（20、40 ng/mL）紫杉醇抑制DC細(xì)胞的免疫活性。見圖2。

2.3 LDH殺傷實(shí)驗(yàn)

c組 DC+CIK細(xì)胞在效靶比 5∶1和 10∶1的情況下，殺傷效果明顯高于未經(jīng)紫杉醇處理的a組DC+CIK細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中紫杉醇處理組的細(xì)胞在效靶比為10∶1的情況下，殺傷活性已經(jīng)到達(dá)（91.37±5.24）%，與 a組 DC+CIK細(xì)胞比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 a、c組不同效靶比情況下DC+CIK細(xì)胞殺傷效果比較（%，±s）

表2 a、c組不同效靶比情況下DC+CIK細(xì)胞殺傷效果比較（%，±s）

注：與 a組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01

組別 5∶1 10∶1 20∶1 a組34.43±1.6072.78±4.7793.54±10.02 c組43.25±1.82*91.37±5.24**94.76±9.28

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)瘤體積以及存活時(shí)間

所有治療組的治療效果均明顯好于對(duì)照組（P＜0.05），E組情況明顯好于其他組（P＜0.01）。D 組在前25 d體現(xiàn)出較好的治療效果，但是25 d后瘤體增長速度增加，最終與單用細(xì)胞治療的治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組與E組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明紫杉醇作用于DC細(xì)胞而非CIK細(xì)胞。見圖3。B、C、D、E組的平均存活時(shí)間分別為 33.0、34.0、31.8、41.8 d，明顯高于對(duì)照A組（23.8 d）（P＜0.05）。E組平均存活時(shí)間大于41.8 d，明顯高于B、C、D 組（P ＜0.01）。其中E組45d仍有 3只存活。見圖4。A組裸鼠于28 d全部死亡，B組34 d全部死亡，C組36 d全部死亡，D組36 d全部死亡，E組45d之后仍有3只存活。說明10 ng/mL以下紫杉醇能夠有效地增強(qiáng)DC免疫活性，從而有效扼制腫瘤的生長，延長生存時(shí)間。見圖5。

圖3 瘤體積與時(shí)間的關(guān)系

圖4 裸鼠平均生存時(shí)間

圖5 裸鼠Kaplan-Meier存活曲線

3 討論

近年來，腫瘤的綜合治療已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的單一治療，是繼手術(shù)、放療、化療之后的第四種腫瘤治療模式。生物治療因安全、有效、毒副作用低等特點(diǎn)，被認(rèn)為是目前腫瘤綜合治療模式中最活躍、很有前途的治療手段，但傳統(tǒng)治療理念認(rèn)為化療藥物具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，因此很少與免疫細(xì)胞治療同時(shí)應(yīng)用。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)，特定的一些化療藥物會(huì)在低濃度的情況下，促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)[4]。研究發(fā)現(xiàn)化療藥物有助于提高癌細(xì)胞的免疫原性[5-6]。Ding等[7]發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺與腫瘤過繼細(xì)胞治療 （adoptive cell therapy，ACT）聯(lián)用可以有效促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的分化，CD4+T細(xì)胞可特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞。所有這些發(fā)現(xiàn)都為免疫細(xì)胞聯(lián)合化療治療腫瘤提供了理論基礎(chǔ)。

DC是人體內(nèi)專職的抗原提呈細(xì)胞，具有抗原提呈、激活初始T細(xì)胞、分泌免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子、分泌趨化性細(xì)胞因子、趨化T/B細(xì)胞等多種免疫調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞（CIK細(xì)胞）共同表達(dá)CD3與CD56兩種細(xì)胞因子。其主要組成為共表達(dá)CD3和CD56的T細(xì)胞。這種T細(xì)胞具有T淋巴細(xì)胞的殺傷活性以及自然殺傷細(xì)胞的非MHC限制的優(yōu)點(diǎn)[7]。成熟的DC與CIK共培養(yǎng)，可以促進(jìn)CIK的殺傷能力[8-10]。因此，DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞作為免疫治療中重要的兩個(gè)部分，常聯(lián)合應(yīng)用以增強(qiáng)免疫治療的臨床療效。

紫杉醇為廣譜化療藥物，主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤的治療。紫杉醇通過促進(jìn)微管蛋白聚合來抑制有絲分裂，從而到達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[11-12]。由于DC細(xì)胞極低的分裂能力，其對(duì)紫杉醇的耐受能力較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在共培養(yǎng)6 d的前提下，5、10 ng/mL組第6天存活率與第0天存活率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），存活率接近 100%，說明 DC細(xì)胞能耐受濃度在10 ng/mL以下的紫杉醇，紫杉醇濃度超過10 ng/mL對(duì)DC細(xì)胞的存活率有較大的影響，20、40 ng/mL組第6天存活率與第0天存活率相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。20 ng/mL的紫杉醇使DC細(xì)胞的存活率下降到45%；濃度40 ng/mL的紫杉醇共培養(yǎng)6 d的DC細(xì)胞，存活率僅為17.5%。此外，紫杉醇在中低濃度（5、10 ng/mL）下上調(diào)DC細(xì)胞表面MHCⅡ分子以及 CD40、CD86等共刺激分子表達(dá)，增強(qiáng)其呈遞抗原、啟動(dòng)免疫應(yīng)答的能力。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示紫杉醇能顯著上調(diào)DC細(xì)胞對(duì)于IL-12的分泌表達(dá)，但是具體上調(diào)機(jī)制還有待探究。IL-12有促進(jìn)幼稚T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞的作用[13]，并能激活 NK細(xì)胞和T細(xì)胞，誘生 IFN-γ、TNF-α。本研究的體外殺傷實(shí)驗(yàn)中觀察到紫杉醇預(yù)處理的DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，CIK細(xì)胞的殺傷能力顯著高于未處理的DC+CIK組。因?yàn)镃IK細(xì)胞同時(shí)具備NK細(xì)胞和普通T細(xì)胞的特點(diǎn)，符合IL-12的作用特點(diǎn)，因此推測(cè)殺傷能力的上升可能與紫杉醇顯著上調(diào)DC細(xì)胞IL-12分泌有關(guān)。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，所有治療組腫瘤體積都明顯小于對(duì)照組（P＜0.01），但 CIK組和 DC+CIK組并無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其原因有可能是CIK細(xì)胞的殺傷作用為非MHC依賴，而且DC在裸鼠體內(nèi)不能找到除了CIK細(xì)胞以外的呈遞抗原的效應(yīng)細(xì)胞。單用紫杉醇治療的化療組在前25 d顯現(xiàn)出較好的治療效果，但是25 d后瘤體增長速度增加，最終與單用細(xì)胞治療的治療組無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差距。其原因可能在于紫杉醇的抑瘤原理：雖然紫杉醇能通過促進(jìn)微管蛋白聚合來抑制有絲分裂，從而有效地抑制處于生長周期中分裂期的腫瘤細(xì)胞的生長，但是對(duì)于其他微管蛋白表達(dá)低下時(shí)期的腫瘤細(xì)胞并無明顯效果。然而，在紫杉醇體內(nèi)藥量衰減后，處于非分裂期的細(xì)胞進(jìn)入分裂期，并大規(guī)模分裂，從而嚴(yán)重影響了紫杉醇藥物的持續(xù)效應(yīng)。紫杉醇+DC+CIK治療組相對(duì)于其他治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。紫杉醇+DC+CIK治療組裸鼠的存活時(shí)間比其他組有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05），其中在45 d之后仍有3只裸鼠存活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上文所推測(cè)的紫杉醇增強(qiáng)CIK殺傷力的原理相符。

綜上所述，低中濃度的紫杉醇可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟并提高其抗原呈遞能力。高濃度紫杉醇可殺死樹突狀細(xì)胞，抑制其免疫活性。中濃度紫杉醇能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分泌IL-12。紫杉醇、DC、CIK聯(lián)合應(yīng)用可提高荷瘤裸鼠生存時(shí)間。

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