李紀勤，包振民，李 玲，胡曉麗

（中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東 青島266003）

櫛孔扇貝（Chlamys farreri）是我國主要海水養(yǎng)殖種類之一，優(yōu)良品種培育是產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。規(guī)模開發(fā)櫛孔扇貝分子標記是發(fā)掘其種質(zhì)資源，進行生產(chǎn)性狀的遺傳解析、建立分子育種技術(shù)和培育高產(chǎn)抗逆優(yōu)良品種的基礎工作之一。

在現(xiàn)有的分子標記技術(shù)中，單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）以其二態(tài)易于分型、遺傳穩(wěn)定性高、密度高、易于實現(xiàn)自動化檢測分析等優(yōu)點成為繼擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、微衛(wèi)星（SSR）之后新一代的分子標記，廣泛應用于高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、群體遺傳學等研究［1］。表達序列標簽（EST）數(shù)據(jù)庫發(fā)掘是目前SNP篩選的重要途徑。相比基因組來源的標記，EST－SNP均來自轉(zhuǎn)錄的基因。EST－SNP用于數(shù)量性狀位點（QTL）研究可直接將目標性狀定位到相關(guān)基因，有利于性狀的遺傳解析。

水產(chǎn)動物中EST－SNP標記開發(fā)已經(jīng)有若干報道，如大西洋 鱈 魚［2］、大 菱 鲆［3］、對 蝦［4］、蟹［5］、太 平 洋 牡蠣［6］、太平洋鮑［7］、海灣扇貝［8］、蝦夷扇貝［9］等。在櫛孔扇貝中也開發(fā)了少量SNP標記［10－12］，但數(shù)量遠未達到高密度連鎖圖譜構(gòu)建和QTL精細定位的要求。

目前已報導的SNP檢測和標記開發(fā)技術(shù)有許多種［13］，如基于構(gòu)象改變的SSCP、DGGE、DHPLC等，基于雜交的TaqMan、microarray等，以及基于引物延伸的DNA測序如焦磷酸測序等。盡管方法眾多，但分別存在開發(fā)通量低、操作繁瑣、費用高、適用范圍有限等問題，限制了SNP標記在非模式生物中的開發(fā)和利用。近年來，高分辨率熔解曲線（High resolution melting，HRM）被證明是一種通量大、效率高的SNP檢測技術(shù)［14］，其原理是基于不同等位形式對退火溫度Tm的影響，通過熔解曲線的變化確定基因型。另外，可應用非標記探針進行HRM檢測，從而大幅降低SNP標記開發(fā)成本［15］。本研究對櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行EST－SNP篩查，利用改進的HRM非標記探針技術(shù)進行SNP驗證分型，開發(fā)了33個EST－SNP標記，可用于櫛孔扇貝的遺傳和育種研究。

1 材料與方法

1.1 模板DNA的制備

實驗所用櫛孔扇貝樣品分別取自4個野生群體（長島、榮成、青島、日照），其中長島、榮成、日照群體各12個個體，青島群體48個個體。分別取其閉殼肌液氮速凍后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱中保存。利用酚－氯仿法提取冷凍樣品的DNA［16］，紫外分光光度計定量，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 EST－SNP的查找和引物、探針設計

本課題組之前對櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組進行了454測序，EST序列經(jīng)過拼接后，利用QualitySNP程序?qū)?條以上EST的拼接序列（contig）進行比對分析，查找候選SNP位點。選擇2種等位形式均至少在2條EST序列中重復出現(xiàn)的單堿基突變作為候選SNP，進行后續(xù)驗證分型。

針對每一候選位點設計2條引物，并對每個獲得預期擴增產(chǎn)物的位點設計一條非標記非修飾探針［15］。利用在線程序Primer3V4.0進行引物的設計，引物長度至少19nt，Tm在59～61℃之間，預期PCR產(chǎn)物大小不超過150bp。預期擴增產(chǎn)物中只能包含一個候選SNP位點。探針設計采取如下標準：1）目標位點盡量位于探針序列的中間位置；2）Tm介于59～61℃，Tm可利用在線程序 Oligo Calculator V3.25（http：／／www.basic.northwestern.edu／biotools／oligocalc.htm）進行估計；3）探針長度20～35nt；4）探針設計完成后，在3′端添加2個錯配堿基，進行3′端封閉，防止探針作為引物延伸；5）探針和引物序列不能有重疊。引物和探針由上海生工生物工程公司合成。

1.3 引物驗證和位點多態(tài)性檢測

以4個群體每個群體12個個體DNA等量混合作為模板DNA，進行引物的檢測。實驗采用10μL體系的不對稱PCR（15ng模板DNA，0.1μmol／L正向引物，0.5μmol／L反向引物，1.5mmol／L MgCl2，2.0 mmol／L dNTP，1UrTaq DNA聚合酶，1XLCGreen Plus染料），95℃變性5min之后，進行60個循環(huán)的擴增（95℃40s，60℃40s，72℃40s），最后在72℃延伸5min。利用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

根據(jù)電泳結(jié)果，選擇產(chǎn)生大小符合預期、單一條帶PCR產(chǎn)物的位點進行探針的檢測并對4個群體的48個個體進行分型，PCR反應體系如前所述。擴增反應結(jié)束后，向每個反應添加相應的探針至終濃度達到2.0 μmol／L，95℃變性5min后25℃復性30s。HRM分析利用LightScanner儀器進行，以0.1℃／s的速率緩慢從40℃升溫至95℃，以0.1℃的分辨率采集熒光信號，利用LightScanner軟件進行熒光信號的分析處理。

1.4 遺傳參數(shù)估計

選擇在4個群體中檢測為多態(tài)性的位點，對青島群體48個個體進行分型，并進行相關(guān)遺傳參數(shù)的統(tǒng)計。利用PopGen32計算低頻等位基因（Minor allele）頻率、觀測雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）。利用在線軟件 GENPOPE（http：∥genepop.curtin.edu.au／）進行 Hardy－Weinberg平衡（Hardy－Weinberg equilibrium，HWE）和連鎖不平衡分析。

1.5 多態(tài)SNP功能注釋

對驗證為多態(tài)SNP，提取其所在的contig序列，利用NCBI的BLASTX程序進行功能注釋。P＜1×e－5作為同源序列判定的閾值標準。利用ORF finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）查找EST中的開放閱讀框，確定SNP在遺傳密碼子的位置，與標準密碼子比對確定該突變是否引起編碼氨基酸的改變。

2 結(jié)果

2.1 櫛孔扇貝EST序列中的SNP篩查

本課題組前期對櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組進行了454高通量測序，EST序列經(jīng)過拼接后共獲得38 944條contig。在其中18 780條含4條以上EST的contig中共檢測到21 813個候選SNP位點，SNP平均頻率為426.5 bp。SNP位點中，轉(zhuǎn)換14 641個（A／G 7 408、C／T 7 233）、顛換7 172個（A／C 2 000、A／T 2 500、G／T 1 708、G／C 914）。其中，A／G 突變最 多，占 總 數(shù)的34.0%；G／C突變最少，占總數(shù)的4.2%。

2.2 候選SNP位點的分型

根據(jù)SNP位點側(cè)翼序列的保守性和位點分布頻率，選取90個位點設計引物。其中，66個位點產(chǎn)生符合預期大小的單一條帶，24個位點（26.7%）擴增產(chǎn)物大于預期。對符合預期的66個位點設計合成探針，并利用4個群體共48個個體進行多態(tài)性檢測。結(jié)果顯示，其中18個位點（20.0%）無法準確分型，另有15個位點（16.7%）在檢測的個體中無多態(tài)性，因此，能明顯區(qū)分出2種不同基因型的位點為33個（36.7%）。圖1所示為多態(tài)位點C15117S745＿AG的HRM分型結(jié)果。33個多態(tài)位點的信息已提交到GenBank。

圖1 SNP位點C15117S745＿AG的非標記探針HRM分型檢測結(jié)果Fig.1 Genotyping result of SNP C15117S745＿AG using HRM assay with unlabeled probe

利用青島野生群體對33個多態(tài)位點作進一步的驗證分型。低頻等位基因頻率介于0.052 1～0.479 6，觀測雜合度Ho和期望雜合度He的分布范圍分別為0.062 5～0.744 7和0.099 8～0.504 6（見表1）。所有位點都處于連鎖平衡狀態(tài)，其中5個位點偏離HWE。

表1 櫛孔扇貝33個多態(tài)SNP位點信息Table 1 Characterization of 33polymorphic SNP loci for Zhikong scallop（Chlamys farreri）

續(xù)表1

2.3 櫛孔扇貝EST－contig的功能注釋

利用NCBI的BLASTX程序，對33個多態(tài)SNP對應的contig序列進行了功能注釋（見表2）。其中，6個SNP所在的contig沒有找到其有效匹配；26個SNP對應可以注釋的contig，涉及的基因包括轉(zhuǎn)甲基酶（Putative methyltransferase NSUN5）、tRNA 特異腺苷脫氨酶（tRNA－specific adenosine deaminase）、ATP依 賴 的 RNA 解 旋 酶 （ATP－dependent RNA helicase DHX8）、跨膜蛋白（Transmembrane protein 186）等。

利用ORF finder推測出EST正確的開發(fā)閱讀框，確定SNP在遺傳密碼子的位置，與標準密碼子比對發(fā)現(xiàn)C29104S180＿GA位于5′－UTR區(qū)；而 C21017S124＿GA、C28186S356＿AG、C29610S661＿AG、C30899S346＿AG、C32914S602＿TC、C33847S308＿AT、C49262S141＿GA位于密碼子的首位或第二位，C13864S614＿GA位于密碼子第三位，均造成了編碼氨基酸的改變，因此為錯義突變。位點C6364S207＿AC位于起始密碼子第一位，可能造成基因表達的沉默。剩余23個位點均位于密碼子第三位，與標準密碼子比對后確認為同義突變（見表2）。

表2 櫛孔扇貝33個多態(tài)SNP位點的功能注釋Table 2 Functional annotation of 33polymorphic SNPs in Zhikong scallop（Chlamys farreri）

續(xù)表2

3 討論

SNP是基因組中冗余度低而覆蓋度最高的變異，在動植物性狀的精細遺傳解析及人類疾病和健康的遺傳機制研究中具有廣泛的應用前景。與模式生物相比，非模式生物的SNP研究，無論從SNP數(shù)量還是研究方法上，都相對滯后。櫛孔扇貝作為我國重要經(jīng)濟海水養(yǎng)殖種類，就目前研究來看，其分子標記也以微衛(wèi)星標記為主，只有少數(shù)SNP標記被報道［10－12］。本研究中，利用轉(zhuǎn)錄組測序得到櫛孔扇貝大量EST序列，從中獲得候選SNP位點21 813個，EST序列中平均426.5bp含有一個SNP，明顯低于其他水產(chǎn)動物EST中的SNP位點平均間距（如鮑 100bp［3－4］、海灣扇貝118bp［5］、蝦夷扇貝159.2bp［6］）。除了不同物種間可能存在SNP密度差異外，另一個可能的原因是本研究采用了較為嚴謹?shù)腅ST拼接條件（重疊區(qū)≥100bp，相似度≥95%）進行候選SNP位點的查找。

由于功能基因轉(zhuǎn)錄后，mRNA存在剪切編輯，因此通過生物信息技術(shù)篩查的候選SNP位點應在基因組中進行驗證以保證其可靠性。本研究選取的90個候選EST－SNP中，24個位點（26.7%）擴增產(chǎn)物大于預期，推測是由于擴增產(chǎn)物跨越內(nèi)含子造成的，部分位點經(jīng)克隆測序確認了內(nèi)含子的存在。為了降低擴增產(chǎn)物跨內(nèi)含子的可能性，引物設計時應使預期擴增產(chǎn)物盡可能短。成功擴增的66個位點中，15個位點在4個群體中表現(xiàn)為單態(tài)，說明部分候選SNP位點可能存在假陽性；原因可能是由于EST序列通常較短，在聚類分析過程中錯誤地將同源性比較高的非等位基因聚為一簇［17］，增加了假陽性的概率。Wang等［18］認為contig包含的EST數(shù)目和低頻基因頻率是影響EST－SNP開發(fā)成功率的2個最重要因素，contig包含的EST數(shù)目越多、低頻等位基因頻率越高，標記開發(fā)的成功率越高，因此，開發(fā)EST－SNP標記時應該盡量選擇重疊群大和等位基因頻率分布均勻的位點。另有18個位點沒有得到準確的HRM分型結(jié)果，部分原因可能是單一位點的擴增產(chǎn)物中有2個或更多的SNP位點，或者探針存在非特異性結(jié)合。

對獲得的33個SNP標記，在青島野生群體中進行了驗證和群體遺傳多樣性分析。所有位點均顯示為多態(tài)，觀測雜合度Ho和期望雜合度He的分布范圍分別為0.062 5～0.744 7和0.099 8～0.504 6。對比顯示，SNP標記揭示的群體多樣性指數(shù)，如觀測雜合度Ho和期望雜合度 He要低于 AFLP［19］和SSR［20］標記分析的結(jié)果，這是因為SNP標記為雙等位形式，每個位點所攜帶的多態(tài)信息較少。本研究所使用的SNP來源于EST序列，可能受到更高的選擇壓力，因而在群體中保持較低的多態(tài)性水平。Hardy－Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示，33個位點中有5個偏離Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)，表明青島群體可能經(jīng)歷了遺傳漂變、個體遷徙等過程。

從EST中開發(fā)SNP標記的1個顯著優(yōu)點，就是標記直接與功能基因相關(guān)，為將來的遺傳性狀功能解析和功能基因克隆提供了便利。本研究開發(fā)得到的33個SNP位點，其中有8個造成了編碼氨基酸的改變。此類突變可能會進而造成蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的變化，對表型產(chǎn)生影響。對比其它海洋貝類，如海灣扇貝、鮑、長牡蠣中，已報道的EST－SNP多產(chǎn)生同義突變，鮮有非同義突變，可能與物種基因組特征或者這些物種中已有的SNP位點數(shù)目較少有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)一個SNP位點位于5′－UTR區(qū)，有可能與相關(guān)基因的表達調(diào)控有關(guān)，另有1個SNP引起起始密碼子的改變，可能會影響蛋白質(zhì)的完整性和功能。對上述基因和位點的進一步研究正在進行中。

［1］ Liu Z J，Cordes J F.DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics［J］.Aquaculture，2004，238：1－37.

［2］ Moen T，Hayes B，Nilsen F，et al.Identification and characterization of novel SNP markers in Atlantic cod：Evidence for directional selection［J］.BMC Genet，2008，9：18.

［3］ Vera M，Alvarez－Dios J A，Millan A，et al.Validation of single nucleotide polymorphism （SNP）markers from an immune expressed sequence tag（EST）turbot，Scophthalmus maximus，database［J］.Aquaculture，2011，313：31－41.

［4］ Yu M，Cheng Y，F(xiàn)othschild M F.SNP analysis of Molting related genes in Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei shrimp（Brief report）［J］.Archiv Fur Tierzucht，2006，4：411－412.

［5］ Ma H，Ma Q，Ma C，et al.Isolation and characterization of genederived single nucleotide polymorphism （SNP）markers in Scylla paramamosain ［J］.Biochem Syst Ecol，2011，39：419－424.

［6］ Sauvage C，Bierne N，Lap gue S，et al.Single Nucleotide polymorphisms and their relationship to codon usage bias in the Pacific oyster Crassostrea gigas［J］.Gene，2007，406（1－2）：13－22.

［7］ Qi H，Liu X，Zhang G.Characterization of 12single nucleotide polymorphisms（SNPs）in Paci？c abalone Haliotis discus hannai［J］.Mol Ecol Resour，2008，8（5）：974－976.

［8］ Li R，Li Q，Kong L.Characterization of expressed sequence tagderived single－nucleotide polymorphisms in the bay scallop Argopecten irradians irradians ［J］.Fish Sci，2009，75（6）：1389－1400.

［9］ Liu W，Li H，Bao X，et al.The first set of EST－derived single nucleotide polymorphism markers for Japanese Scallop，Patinopecten yessonsis ［J］.J World Aquacult Soc，2011，42（3）：456－461.

［10］ Huan P，Zhang X，Li F，et al.Chromosomal localization and molecular marker development of the lipopolysaccharide and beta－1，3－glucan binding protein gene in the Zhikong scallop Chlamys farreri （Jones et Preston）（Pectinoida，Pectinidae）［J］.Genet Mol Biol，2010，33（1）：36－43.

［11］ Wang X，Meng X，Song B，et al.SNPs in the myostatin gene of the mullusk Chalmys farreri：Association with growth traits［J］.Comp Biochem Phys B，2010，155：327－330.

［12］ Jiang G，Li J，Li L，et al.Development of 44gene－based SNP markers in Zhikong scallop，Chlamys farreri ［J］.Cons Genet Resour，2011，3（4）：659－663.

［13］ Garvin M R，Saitoh K，Gharrett A J.Application of single nucleotide polymorphisms to non－model species：a technical review［J］.Mol Ecol Resour，2010，10（6）：915－934.

［14］ Li F，Niu B，Huang Y，et al.Application of high－resolution DNA melting for genotyping in Lepidopteran non－model species：Ostrinia furnacalis（Crambidae）［J］.PloS ONE，2012 7（1）：29664.

［15］ Wang S，Zhang L，Meyer E，et al.Construction of a high－resolution genetic linkage map and comparative genome analysis for a reef－building coral Acropora millepora［J］.Genome Biol，2009，10（11）：126.

［16］ Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

［17］ 王紹宗，李莉，亓海剛，等.長牡蠣（Crassostrea gigas）17個EST－SNP標記的開發(fā)［J］.海洋與湖沼，2010，41（2）：274－281.

［18］ Wang S，Sha Z，Sonstegard T，et al.Quality assessment parameters for EST－derived SNPs from catfish ［J］.BMC Genomics，2008，9：450.

［19］ 趙翠.櫛孔扇貝與西施舌的群體遺傳學研究［D］.青島：中國海洋大學，2008.

［20］ 戰(zhàn)愛斌.櫛孔扇貝（Chlamys farreri）微衛(wèi)星標記的篩選及應用［D］.青島：中國海洋大學，2007.