葉 麗，劉亞青，巨修練

（武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430074）

1 酪氨酸酶的主要功能

酪氨酸酶又稱(chēng)酚氧化酶、多酚氧化酶、兒茶酚氧化酶，是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含銅金屬氧化酶，廣泛存在于微生物、動(dòng)植物以及人體中[1，2］。在生物體內(nèi)，酪氨酸酶對(duì)酪氨酸和其它酚類(lèi)化合物的代謝及黑色素的合成起重要的催化作用[3］。在合成黑色素過(guò)程中，酪氨酸酶主要參與兩類(lèi)反應(yīng)：催化L－酪氨酸羥基化為L(zhǎng)－多巴（單酚酶活性）；氧化L－多巴形成多巴醌（二酚酶活性）[4，5］，兩類(lèi)反應(yīng)都必須有氧的參與。

酪氨酸酶是合成黑色素的關(guān)鍵酶，但其在體內(nèi)的異常過(guò)量表達(dá)卻可導(dǎo)致人體的許多色素沉淀性皮膚病，如雀斑、黃褐斑、老年斑等[6］。水楊酸類(lèi)、壬二酸類(lèi)、熊果甙、曲酸、氫醌、維生素C衍生物以及一些中藥提取物等常被用作化妝品中的增白劑，其原理就是作為酪氨酸酶的抑制劑，可以有效地抑制酪氨酸酶的活性，從而阻止黑色素的不斷累積，達(dá)到美白的效果。水果、蔬菜等食品的褐變也是由于酪氨酸酶的作用，因而酪氨酸酶抑制劑也被用作食品保鮮的添加劑，防止食品的褐變[7］。此外，酪氨酸酶還是昆蟲(chóng)賴(lài)以生存的一種重要酶，其催化合成的黑色素可以保護(hù)昆蟲(chóng)免受紫外線過(guò)度輻射，也與昆蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中的鞣化以及傷口愈合有關(guān)[8］。因此，酪氨酸酶抑制劑越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前，對(duì)其抑制機(jī)理、抑制動(dòng)力學(xué)以及應(yīng)用有了一定的了解，并合成了大量有價(jià)值的新型抑制劑，但尋求特異性更高、毒性更低的酪氨酸酶抑制劑仍是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

2 酪氨酸酶的活性中心結(jié)構(gòu)

截至目前，已經(jīng)有幾十種酪氨酸酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu)被解析出來(lái)，這些酪氨酸酶主要來(lái)源于Streptomyces castaneoglobisporus （鏈霉菌）、Bacillus megaterium（巨大芽孢桿菌）、Agaricus bisporus（雙孢蘑菇）、Citrobacter freundil（弗式檸檬酸桿菌）、Citrobacter intermedius（檸檬酸桿菌）等。酪氨酸酶的活性中心是疏水性的[7］，含有2個(gè)Cu2＋，每個(gè) Cu2＋分別與蛋白質(zhì)中相鄰的3個(gè)組氨酸殘基結(jié)合，另有一個(gè)內(nèi)源橋基將這2個(gè)Cu2＋聯(lián)系在一起[9］，如圖1所示。

圖1 蘑菇酪氨酸酶的活性中心Fig.1 Active center of mushroom tyrosinase

酪氨酸酶在催化反應(yīng)中，其雙核Cu2＋活性中心以3種形式存在：還原態(tài)（Met）、氧化態(tài)（Oxy）和脫氧態(tài)（Deoxy）。只有氧化態(tài)酶（EOxy）具有單酚加羥酶活性，氧化態(tài)酶首先與單酚類(lèi)化合物（M，單酚酶活性）或二酚類(lèi)化合物（D，二酚酶活性）反應(yīng)，生成醌及脫氧態(tài)酶（EDeoxy）；然后脫氧態(tài)酶才能夠結(jié)合氧分子，再度生成氧化態(tài)酶，進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)。還原態(tài)酶（EMet）只具有二酚酶活性，只能與二酚結(jié)合[10］。圖2詳細(xì)闡明了3種形式的酪氨酸酶催化氧化單酚以及二酚的過(guò)程。

圖2 酪氨酸酶催化單酚羥基化（Ⅰ）以及二酚氧化（Ⅱ）過(guò)程Fig.2 The catalytic process of the hydroxylation of monophenol（Ⅰ）and oxidation of o－diphenol（Ⅱ）by tyrosinase

3 酪氨酸酶抑制劑的抑制機(jī)理

對(duì)抑制劑而言，一般根據(jù)抑制劑與酶作用后是否引起酶永久性失活，將其分為可逆抑制劑與不可逆抑制劑。酪氨酸酶的抑制特征表現(xiàn)為可逆抑制[11］，即抑制劑與酶的結(jié)合是一個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。抑制劑濃度增大會(huì)導(dǎo)致酶活力下降，但抑制劑只是使酶活力受到抑制，而不能使酶永久性失活，當(dāng)抑制劑濃度降低時(shí)，酪氨酸酶活力會(huì)上升。根據(jù)酪氨酸酶抑制劑與酶作用位點(diǎn)及方式的不同，可將其分為競(jìng)爭(zhēng)型、非競(jìng)爭(zhēng)型、混合型及緩慢結(jié)合型4種類(lèi)型，其主要機(jī)理見(jiàn)表1 。

然而，由于分子的多樣性，酪氨酸酶抑制劑的作用機(jī)理非常復(fù)雜。一種抑制劑可能同時(shí)具備幾種抑制機(jī)理；同種抑制劑針對(duì)不同底物，抑制機(jī)理也不同。要明確抑制劑屬于哪種類(lèi)型，需綜合分析其以哪一種抑制機(jī)理為主，并通過(guò)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定其抑制類(lèi)型。

4 酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展

4.1 競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑

宋康康等[12］和邱龍新等[13］等分別研究了熊果甙和鞣酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。熊果甙和鞣酸都是來(lái)源于天然物質(zhì)中的具有游離酚羥基的物質(zhì)，兩者對(duì)酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶均具有抑制作用，均能使酪氨酸酶的單酚酶遲滯時(shí)間明顯延長(zhǎng)，但對(duì)穩(wěn)定態(tài)酶活力影響較小。160mmol·L－1的熊果甙可使單酚酶遲滯時(shí)間從82s延長(zhǎng)到430s，但穩(wěn)定態(tài)酶活力僅下降16%；2.0μmol·L－1的鞣酸可使單酚酶遲滯時(shí)間從104.7s延長(zhǎng)到333.6s，但穩(wěn)定態(tài)酶活力僅下降19.8%。熊果甙和鞣酸同為酪氨酸酶二酚酶的可逆競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，對(duì)二酚酶的抑制效應(yīng)表現(xiàn)出濃度依賴(lài)關(guān)系，導(dǎo)致二酚酶活力下降50%的抑制濃度（IC50）分別為5.30mmol·L－1和65μmol·L－1。抑制機(jī)理是熊果甙本身作為酶底物的類(lèi)似物，而鞣酸組成中的沒(méi)食子酸也與酶底物分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似，兩者都能競(jìng)爭(zhēng)性地與酶活性中心結(jié)合，從而抑制酶活力。

表1 酪氨酸酶抑制劑的抑制機(jī)理Tab.1 Inhibitory mechanisms of tyrosinase inhibitors

陸珊等[14］對(duì)曲酸抑制馬鈴薯酪氨酸酶的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，酪氨酸酶催化L－酪氨酸羥基化過(guò)程中，曲酸可以延長(zhǎng)單酚酶的遲滯時(shí)間，并且可降低酶促反應(yīng)速率。曲酸與酪氨酸酶作用的底物之一L－多巴分子結(jié)構(gòu)較相似，環(huán)上有親水性的羥基結(jié)構(gòu)，在酶催化氧化L－多巴反應(yīng)中表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。曲酸還具有還原性，可以將合成黑色素的反應(yīng)中間產(chǎn)物多巴醌還原成酚，從而阻礙黑色素的生成。

鑒于曲酸抑制酪氨酸酶活性主要源于γ－吡喃酮結(jié)構(gòu)中含有烯醇的羥基，Rho等設(shè)計(jì)并合成了3，4－甲二氧基肉桂酸酯曲酸。研究表明，以L－酪氨酸為底物時(shí)，3，4－甲二氧基肉桂酸酯曲酸較曲酸具有更強(qiáng)的抑制蘑菇酪氨酸酶活性的能力，這是因?yàn)?，其分子結(jié)構(gòu)中含有的肉桂酸酯疏水基團(tuán)可以更好地存在于酪氨酸酶活性中心的疏水環(huán)境中，從而增強(qiáng)曲酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。另外，動(dòng)力學(xué)研究也表明，3，4－甲二氧基肉桂酸酯曲酸和曲酸是以同一基團(tuán)（即烯醇羥基）競(jìng)爭(zhēng)性抑制蘑菇酪氨酸酶的活性。

王勤等[15］研究了對(duì)氰基苯酚對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。結(jié)果表明，對(duì)氰基苯酚對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用表現(xiàn)為可逆抑制。0.50mmol·L－1的對(duì)氰基苯酚可使單酚酶遲滯時(shí)間從18s延長(zhǎng)到80s，穩(wěn)定態(tài)酶活力下降80%。對(duì)氰基苯酚、對(duì)羧基苯酚、對(duì)醛基苯酚、熊果甙對(duì)蘑菇酪氨酸二酚酶活性的影響見(jiàn)表2 。

由表2 可知，對(duì)氰基苯酚、對(duì)羧基苯酚、對(duì)醛基苯酚、熊果甙的IC50值分別為0.80mmol·L－1、1.30 mmol·L－1、1.15mmol·L－1和5.30mmol·L－1。這是因?yàn)椋?種化合物在分子結(jié)構(gòu)上具有相似性，都主要含有一個(gè)苯酚，它們對(duì)酪氨酸酶二酚酶均表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制效應(yīng)，只是由于對(duì)位所含的基團(tuán)不同，其提供電荷能力就不同，抑制強(qiáng)度也有區(qū)別，隨著提供電荷能力的增大（4種基團(tuán)提供電荷能力大小為：氰基＞醛基＞羧基＞糖苷基），抑制強(qiáng)度遞增。

Ha等[16］合成了羥基取代苯基萘家族中的一個(gè)新化合物4－（6－羥基－2－萘基）－1，3－苯二酚（HNB）。研究表明，作為氧化白藜蘆醇的電子等排體，HNB可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制蘑菇酪氨酸酶的活性，抑制效應(yīng)表現(xiàn)為濃度依賴(lài)關(guān)系，IC50值為0.07μmol·L－1。HNB及與其結(jié)構(gòu)具有相似性的氫醌、曲酸以及白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效應(yīng)見(jiàn)表3 。

表2 化合物對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶抑制效應(yīng)的比較Tab.2 Inhibitory effects comparison of compounds on mushroom tyrosinase

表3 HNB、氫醌、曲酸、白藜蘆醇對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的抑制效應(yīng)Tab.3 Inhibitory effects of HNB，hydroquinone，kojic acid and resveratrol on mushroom tyrosinase

傅博強(qiáng)等[17］研究了甘草中4種黃酮類(lèi)化合物甘草甙、異甘草素－葡萄糖芹菜甙、異甘草甙和甘草查爾酮對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的抑制作用。結(jié)果表明，甘草甙對(duì)酪氨酸單酚酶沒(méi)有抑制作用，而其它3種黃酮類(lèi)化合物都是酪氨酸酶單酚酶的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，IC50值分別為 0.072mmol·L－1、0.038mmol·L－1、0.0258mmol·L－1。這是因?yàn)?，甘草甙為雙氫黃酮，分子剛性大，故沒(méi)有抑制作用；其它3種為查爾酮，分子結(jié)構(gòu)與L－酪氨酸類(lèi)似，易與酶活性中心結(jié)合而產(chǎn)生抑制作用。

1999年，Kubo等[18］從藏紅花中提取出黃酮醇－堪非醇并研究其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用及機(jī)理。結(jié)果表明，黃酮醇－堪非醇具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制蘑菇酪氨酸酶催化氧化L－多巴的能力，IC50值為0.23mmol·L－1、ID50值為67μg·mL－1。Chang等[19］發(fā)現(xiàn)6，7，4′－三羥基異黃酮是酪氨酸酶的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，其對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制作用的IC50值為9.2μmol·L－1。Jeong等[20］從Zanthoxylum piperitum 的葉子中分離出的礫精（Quercetin）對(duì)酪氨酸酶具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，IC50值為3.8μg·mL－1。另有研究證實(shí)高良櫟精、非瑟酮、3，7，4′－三羥基黃酮和桑色素等黃酮醇都是酪氨酸酶的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。黃酮醇競(jìng)爭(zhēng)性抑制酪氨酸酶活性的機(jī)理為：這類(lèi)黃酮醇具有一個(gè)公共的3－羥基－4－酮基團(tuán)，具有螯合酪氨酸酶活性中心Cu2＋的作用，從而使得酶失活。

薛超彬等[21］研究了銅鐵試劑對(duì)菜青蟲(chóng)多酚氧化酶的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銅鐵試劑對(duì)多酚氧化酶有明顯的可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。Shiino等[22］合成了一系列N－取代的亞硝基羥基胺類(lèi)化合物，其中Dopastin是酪氨酸酶的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)這類(lèi)化合物大多能抑制蘑菇酪氨酸酶的活性，并且N－取代亞硝基和N－取代羥基是這類(lèi)化合物具有酪氨酸酶抑制活性的必需基團(tuán)。銅鐵試劑和N－取代的亞硝基羥基胺類(lèi)化合物對(duì)不同酪氨酸酶的抑制機(jī)理是：通過(guò)互變異構(gòu)體與酶作用底物競(jìng)爭(zhēng)，螯合了酶活性中心的Cu2＋，使酶活性中心的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使酶活性降低。

此外，Ha等發(fā)現(xiàn)5－取代苯亞甲基－2，4－噻唑烷二酮類(lèi)化合物Ⅰ和Ⅱ[23］、5－取代苯亞甲基乙內(nèi)酰脲類(lèi)化合物Ⅲ[24］以及2－取代苯基－4－取代羧基噻唑烷類(lèi)化合物Ⅳ[25］都是酪氨酸酶強(qiáng)效的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。抑制機(jī)理較復(fù)雜：一方面分子中的S可以絡(luò)合酶活性中心的雙核Cu2＋，這與N－苯基硫脲抑制酪氨酸酶活性的機(jī)理一樣，即硫脲中的S取代還原態(tài)的酪氨酸酶活性中心2個(gè)Cu2＋之間的橋聯(lián)配體，與酶活性中心形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而抑制酪氨酸酶的活性；另一方面，亞氨基、羧基以及酰亞胺可以與酪氨酸酶活性中心以外的氨基酸殘基反應(yīng)或者形成氫鍵，從而阻斷酪氨酸酶和底物L(fēng)－酪氨酸以及L－多巴的結(jié)合。

4.2 非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑

苯甲酸、苯甲醛、對(duì)醛基苯甲酸、茴香醛、茴香酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用見(jiàn)表2 。

由表2 可看出，這幾類(lèi)化合物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制類(lèi)型一致，均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，說(shuō)明苯甲醛和苯甲酸結(jié)構(gòu)決定抑制作用類(lèi)型，而茴香醛、茴香酸分子結(jié)構(gòu)中甲氧基對(duì)酶的抑制作用類(lèi)型并無(wú)影響，且對(duì)位上的甲氧基可以增強(qiáng)抑制效果。

Wang等[26］發(fā)現(xiàn)，4－氟苯甲酸、4－氯苯甲酸、4－溴苯甲酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶均有抑制作用，它們對(duì)二酚酶的抑制作用表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性的可逆抑制，其IC50值分別為0.26mmol·L－1、0.20mmol·L－1、0.18mmol·L－1，抑制常數(shù)分別為0.25mmol·L－1、0.20mmol·L－1、0.17mmol·L－1。林敏等[27］研究了4－氟苯甲酸、4－氯苯甲酸、4－溴苯甲酸對(duì)馬鈴薯多酚氧化酶的抑制效應(yīng)，其IC50值分別為0.635 mmol·L－1、0.370mmol·L－1、0.300mmol·L－1，抑制常數(shù)分別為0.632mmol·L－1、0.365mmol·L－1、0.303mmol·L－1。兩篇文獻(xiàn)報(bào)道的4－鹵代苯甲酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶及馬鈴薯多酚氧化酶的抑制作用類(lèi)型一致，均為可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，并且隨著鹵族元素分子量的增大，抑制效果不斷增強(qiáng)。推測(cè)4－鹵代苯甲酸抑制酪氨酸酶的活性機(jī)理為：4－鹵代苯甲酸結(jié)合酶活性中心之外的氨基酸殘基，通過(guò)空間位阻或者改變酶的空間結(jié)構(gòu)，從而抑制酶與底物的結(jié)合。

Kubo等發(fā)現(xiàn)從茴芹油中提取的茴香醛、從橄欖油中提取的一系列α，β－不飽和醛、從枯茗中提取的對(duì)異丙基苯醛、從其它植物中提取的對(duì)甲氧基水楊醛以及Matsuura等從檸檬精油中提取的檸檬醛等都是酪氨酸酶的非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。這些醛類(lèi)化合物中的醛基可以結(jié)合酪氨酸酶活性中心之外的氨基酸殘基，最典型的就是與殘基中的－OH、－NH2、－SH等親核基團(tuán)結(jié)合成穩(wěn)定的席夫堿配合體結(jié)構(gòu)，生成的產(chǎn)物在疏水性的酪氨酸酶活性中心能穩(wěn)定存在，并形成空間位阻，阻止底物與酪氨酸酶活性中心的作用，從而抑制酪氨酸酶的活性。另有研究表明，在醛基化合物的醛基對(duì)位引入推電子基團(tuán)將使得化合物的抑制效果明顯增強(qiáng)，推電子能力越強(qiáng)，抑制效果越好，這可能是因?yàn)橥齐娮踊鶊F(tuán)增強(qiáng)了席夫堿的穩(wěn)定性。

宮霞等[28］測(cè)定了銀杏葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。當(dāng)提取液的濃度為0.16g·L－1時(shí)，可最大限度抑制酶的活性，抑制率達(dá)到52.38%。銀杏葉提取物的主要成分是黃酮和內(nèi)酯，含有多個(gè)還原性的羥基。推測(cè)其抑制機(jī)理可能為：還原性的羥基具有孤對(duì)電子，與酶作用底物競(jìng)爭(zhēng)性地絡(luò)合酶分子活性中心的Cu2＋，從而影響酶的活性；及時(shí)清除氧自由基，終止了自由基鏈的引發(fā)，使得酪氨酸酶的催化氧化反應(yīng)不能順利進(jìn)行；作為強(qiáng)的抗氧化劑，拮抗氧對(duì)酪氨酸酶的激活。

Kang等[29］從可食用昆布屬多莖目褐藻中提取出5種 Phloroglucinol衍生物，分別為：Glucinol、Eckstolonol、Eckol、Phlorofucofuroeckol及 Dieckol。

這5種化合物分子中均含有多個(gè)酚羥基，對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制作用的IC50值分別為92.8μg·mL－1、126μg·mL－1、33.2μg·mL－1、177μg·mL－1、2.16 μg·mL－1。動(dòng)力學(xué)分析可知：Eckol、Phlorofucofuroeckol以及Dieckol為蘑菇酪氨酸酶的非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，抑制常數(shù)分別為1.9×10－5mol·L－1、1.4×10－3mol·L－1和1.5×10－5mol·L－1。Glucinol和Eckstolonol則為酶的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。此外含有多個(gè)酚羥基的天然化合物毛地黃黃酮、7－葡萄糖苷毛地黃黃酮以及甘草黃酮也是酪氨酸酶二酚酶的非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑[3］，IC50值分別為0.190mmol·L－1、0.500mmol·L－1和0.004mmol·L－1。

4.3 混合型抑制劑

郭云集等[30］研究了甘醇酸抑制蘑菇酪氨酸酶的作用機(jī)理。甘醇酸屬于α－羥基酸（又稱(chēng)果酸），可使酪氨酸酶單酚酶的遲滯時(shí)間延長(zhǎng)、穩(wěn)定態(tài)酶活力下降，IC50值為29.74mmol·L－1。另外甘醇酸能可逆性地抑制蘑菇酪氨酸二酚酶的活性，IC50值為1.80mmol·L－1。根據(jù)甘醇酸的分子結(jié)構(gòu)，推測(cè)其抑制作用機(jī)理為：分子中的羧基結(jié)合酶活性中心的Cu2＋形成配位物，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶的活性；分子中的羥基與酶活性中心以外的氨基酸殘基形成氫鍵，阻斷底物與酶的結(jié)合。這兩種作用力使得甘醇酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶具有較強(qiáng)抑制作用，抑制類(lèi)型表現(xiàn)為混合型。

龔盛昭等[31］研究發(fā)現(xiàn)，香草酸對(duì)酪氨酸酶具有較好的抑制作用。香草酸與甘醇酸分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似，分子中既含有羥基，又含有羧基，對(duì)酪氨酸酶的抑制類(lèi)型為可逆混合型，推測(cè)其抑制作用機(jī)理與甘醇酸相似。香草酸可使單酚酶的遲滯時(shí)間延長(zhǎng)，其IC50值為1.3 mmol·L－1，對(duì)二酚酶抑制作用的IC50值為2.6mmol·L－1。

龔盛昭等[32］從牡丹皮中提取出丹皮酚，并研究了丹皮酚對(duì)酪氨酸酶的抑制作用。結(jié)果表明，丹皮酚是酪氨酸酶二酚酶的混合型抑制劑，其對(duì)游離酶和酶－底物復(fù)合物的抑制常數(shù)分別為0.084mmol·L－1和0.12mmol·L－1，IC50值為0.60mmol·L－1。抑制機(jī)理源于丹皮酚一方面可以與酶活性中心的Cu2＋絡(luò)合，另一方面能與酶中氨基酸殘基的氨基形成席夫堿。

陳清西等[33］研究發(fā)現(xiàn)，毛西蕃蓮葉子的水提取物對(duì)酪氨酸酶有較顯著的抑制作用，其對(duì)蘑菇酪氨酸二酚酶抑制作用的IC50值為0.47mg·mL－1，抑制類(lèi)型為可逆混合型；該提取物既通過(guò)與酶作用底物L(fēng)－多巴競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心、抑制酶的活性，抑制常數(shù)為0.56 mg·mL－1，又能與酶－底物復(fù)合物形成酶－底物－抑制劑三元絡(luò)合物從而產(chǎn)生抑制作用，抑制常數(shù)為1.10mg·mL－1。

劉德育等[34］研究了楊梅黃素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用。結(jié)果顯示，楊梅黃素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用表現(xiàn)為濃度依賴(lài)關(guān)系，IC50值為0.082mmol·L－1。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，楊梅黃素是酪氨酸酶的混合型抑制劑，抑制機(jī)理為：一方面楊梅黃素可以清除酶催化反應(yīng)中的過(guò)氧自由基，另一方面楊梅黃素分子中含有的羥基與酶作用底物相似，從而可抑制酶的活性，其對(duì)酶及酶－底物復(fù)合物的抑制常數(shù)分別為0.026mmol·L－1和0.072mmol·L－1。

4.4 緩慢結(jié)合型抑制劑

Jiménez等[35］探究了4位取代間苯二酚對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的影響。研究表明，4位取代間苯二酚是以非經(jīng)典模式的緩慢結(jié)合機(jī)理抑制酪氨酸酶活性的，抑制存在一個(gè)緩沖階段。在酶促反應(yīng)開(kāi)始階段加入抑制劑，反應(yīng)速度會(huì)急劇減慢，隨后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，且隨著抑制劑濃度的增大，反應(yīng)初速度和穩(wěn)定速度都減慢。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，加入抑制劑后，抑制劑與酶迅速形成復(fù)合物，隨后復(fù)合物要經(jīng)歷一個(gè)緩慢的可逆異構(gòu)化過(guò)程。

Espín等[36］研究了環(huán)庚三烯酮對(duì)三種不同來(lái)源的蘑菇酪氨酸酶的抑制機(jī)理。研究表明，環(huán)庚三烯酮是酪氨酸酶的緩慢結(jié)合型抑制劑，增大抑制劑濃度，酶反應(yīng)的初速度和穩(wěn)定速度都會(huì)顯著減慢；反應(yīng)過(guò)程中，先形成酶與抑制劑的復(fù)合物，隨后復(fù)合物要經(jīng)歷一個(gè)緩慢的可逆異構(gòu)化過(guò)程；另外，抑制劑只能與氧化態(tài)的酪氨酸酶結(jié)合，這也證明了緩慢結(jié)合型抑制劑抑制機(jī)理的合理性。此外，Cabanes等發(fā)現(xiàn)L－Mimosine（L－含羞草氨酸）也是蘑菇酪氨酸酶的緩慢結(jié)合型抑制劑。

酪氨酸酶抑制劑的緩慢結(jié)合型抑制模型如圖3所示。

圖3 酪氨酸酶抑制劑的緩慢結(jié)合型抑制模型Fig.3 Slow－binding inhibitory mechanism of tyrosinase inhibitors

由圖3可知，還原態(tài)的酪氨酸酶（EMet）與二酚類(lèi)化合物（D）反應(yīng)形成復(fù)合物（EMet－D），經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)，脫去酚類(lèi)化合物（P），形成氧化態(tài)酶（EOxy）；在沒(méi)有抑制劑的情況下，氧化態(tài)酶結(jié)合二酚類(lèi)化合物形成底物與酶的復(fù)合物（EOxy－D）；該復(fù)合物再經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)，最終又形成還原態(tài)酶，從而循環(huán)反應(yīng)。在有緩慢結(jié)合型抑制劑（I）的情況下，該抑制劑（I）能與氧化態(tài)的酪氨酸酶迅速結(jié)合，形成酶與抑制劑復(fù)合物（EOxy－I）；該復(fù)合物經(jīng)過(guò)一個(gè)緩慢的異構(gòu)化過(guò)程，得到異構(gòu)化的酶與抑制劑復(fù)合物（EOxy－I＊），從而抑制了酶的循環(huán)反應(yīng)。

5 結(jié)語(yǔ)

酪氨酸酶抑制劑主要來(lái)源于：從植物的莖、葉、花、根、果實(shí)等提取出的糖苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、醛類(lèi)、羧酸類(lèi)化合物；采用化學(xué)方法合成的化合物，主要包括醛類(lèi)、羧酸類(lèi)、羥基化合物類(lèi)、含氮氧等的雜環(huán)化合物；從動(dòng)物體內(nèi)提取以及從微生物中分離提取，提取方法主要為溶液浸取和借助儀器提取等。

發(fā)現(xiàn)和鑒別新型高效的酪氨酸酶抑制劑，不僅對(duì)提高蔬菜、水果等食品的質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有重要意義，而且在控制農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)和防治人類(lèi)的許多色素沉著疾病以及其它與黑色素有關(guān)的健康問(wèn)題等方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。研究人員對(duì)酪氨酸酶抑制劑的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、作用機(jī)理、抑制效果進(jìn)行了報(bào)道，但仍有很多方面需要深入探究：不同方法獲得的同種酪氨酸酶抑制劑對(duì)酶的抑制效果為何不同、不同溶液提取出的酪氨酸酶抑制劑對(duì)酶的抑制效果為何不同、同一抑制劑對(duì)不同底物抑制類(lèi)型為何不一樣、同類(lèi)化合物的主要取代基的數(shù)目和位置對(duì)酶抑制作用的影響等。

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