楊金龍 , 李 響 王 沖, 凌 云 包衛(wèi)洋, 沈和定 , 李家樂

(1. 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室, 上海 201306; 2. 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 上海201306; 3. 上海高校知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心, 上海201306; 4. 濱州市海洋與漁業(yè)研究所, 山東 濱州 256616; 5. 揚州大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)研究所, 江蘇 揚州225009)

在海洋環(huán)境中, 當(dāng)一個物體浸入海水, 海洋細(xì)菌將迅速附著在其表面, 并生長、繁殖, 隨后同繁殖的硅藻、真菌、原生動物以及有機碎屑和無機顆粒等形成一層微生物膜[1-2]。微生物膜是污損生物的重要組成部分, 能誘導(dǎo)海洋污損動植物的附著變態(tài),與生物污損的形成關(guān)系密切[3-4], 是許多海洋無脊椎動物附著和變態(tài)的重要自然誘導(dǎo)物。同時, 微生物膜是船舶等浸水設(shè)施表面上最早附著的生物層, 是一個復(fù)雜但可控的微型生態(tài)系統(tǒng)[5], 其形成加速了大型污損生物的附著, 從而引起船舶及海上工程設(shè)施的生物污損及微生物腐蝕, 由此而造成巨大的經(jīng)濟損失[6]。因此, 研究微生物膜對海洋無脊椎動物幼蟲的附著變態(tài)行為對于水產(chǎn)養(yǎng)殖苗種生產(chǎn)技術(shù)的改善和海洋防污技術(shù)的發(fā)展具有極其重要的理論意義和實踐意義[7]。

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)作為中國重要的貝類養(yǎng)殖品種, 而且也是主要的海洋筏式養(yǎng)殖附著生物之一, 分布于黃海、渤海和東海沿岸, 其中以浙江沿海資源量最大。近年來, 人為過度采伐導(dǎo)致厚殼貽貝自然資源逐漸減少, 自然海區(qū)附苗數(shù)量和質(zhì)量明顯下降, 厚殼貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)受到影響。目前, 厚殼貽貝規(guī)?；斯し敝臣夹g(shù)一直沒有得到很好的解決,育苗數(shù)量不穩(wěn)定, 導(dǎo)致苗種供不應(yīng)求。與許多其他海洋無脊椎動物一樣, 厚殼貽貝幼體也要經(jīng)過重要的階段——附著和變態(tài), 在變成附著稚貝后, 其附著數(shù)量直接影響著苗種的產(chǎn)量。

大量研究證明微生物膜能誘導(dǎo)地中海紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)[8]、新西蘭貽貝(Perna canaliculus)[9]、大珠母貝(Pinctada maxima)[10]、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[11]、雜色鮑(Haliotis diversicolor supertexta)[12]等多種經(jīng)濟貝類幼體的附著和變態(tài), 但有關(guān)微生物膜對貝類稚貝附著的影響的研究鮮有報道。本課題組已證明微生物膜誘導(dǎo)厚殼貽貝幼體附著和變態(tài)[13]。然而, 不同鹽度條件下形成的微生物膜對厚殼貽貝稚貝附著的影響的尚未得知。作者研究了低鹽度下形成的微生物膜對厚殼貽貝稚貝附著的影響, 通過分析微生物膜的干質(zhì)量、細(xì)菌密度、硅藻密度、葉綠素 a的含量以及微生物膜細(xì)菌群落多樣性, 來探究微生物膜對厚殼貽貝稚貝附著的影響因素, 旨在為提高厚殼貽貝苗種中間培育提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 稚貝

實驗用厚殼貽貝稚貝取自浙江省舟山市嵊泗縣海洋科技開發(fā)服務(wù)中心, 殼長(3.1 ± 0.5)mm, 殼高(2.2 ± 0. 5)mm, 運回實驗室后暫養(yǎng)1周后用于實驗。暫養(yǎng)期間, 培育水溫為 18℃, 充氣培育, 每天換水及投喂金藻(Isochrysis galbana)。

1.1.2 微生物膜形成

實驗所需的室內(nèi)微生物膜形成于光照培養(yǎng)箱(新苗 GZX-300BS-Ⅲ)中, 溫度控制在 18℃, 光照強度為10 000 lx, 光照周期比為14 h: 10 h。形成微生物膜所用的玻璃片為26 mm × 38 mm, 滅菌后垂直置于人工配置的海水中。海水鹽度為 13、23, 借助REF201手持鹽度折光儀進行校對, 每隔3 d換一次水。微生物膜的日齡設(shè)為7、14、21、28 d, 每個日齡設(shè)置3個重復(fù)。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物膜干重測量

用滅菌玻璃片將微生物膜從載玻片上刮至滅菌海水中, 過濾至 GF/C濾膜(whatman玻璃纖維濾膜,1.2 μm), 干燥箱中干燥, 設(shè)置溫度為80℃, 48 h后對其干質(zhì)量進行測量。

1.2.2 微生物膜中的附著細(xì)菌和底棲硅藻計數(shù)

細(xì)菌和硅藻密度計數(shù)參考Bao等[3]的方法進行。簡單來說, 細(xì)菌計數(shù)時, 將微生物膜固定在 5%的福爾馬林溶液中, 吖啶橙(0.1%)染色5 min后, 1000倍熒光顯微鏡下隨機選取10個點進行計數(shù)。硅藻計數(shù)時, 將含有微生物膜的載玻片直接置于 200倍光學(xué)顯微鏡下、隨機選取10個點進行計數(shù)。

1.2.3 微生物膜葉綠素a的測定

將載有微生物膜的過濾濾膜(0.45 μm, 纖維素酯微孔濾膜)放入具塞離心管中, 加 90%丙酮溶液10 mL搖蕩, 4℃14 h后, 漩渦振蕩儀振蕩1 h。然后, 離心 3 000 r/min, 10 min后取上清液在 UNIC 2100分光光度計上, 用1 cm 光程的比色皿, 分別讀取750、664、647、630 nm 波長的吸光度, 以90%丙酮浸泡的空白濾膜作為空白對照, 按如下公式計算葉綠素a含量[14]:

式中:Ve為恒定的提取液體積(L),D為吸光度,d為微生物膜的面積(cm2),A為比色皿光程(cm)。

1.2.4 附著細(xì)菌的DNA提取

將不同日齡的微生物膜載玻片從海水中取出, 在無菌操作臺中, 將微生物膜收集到 2 mL離心管中,經(jīng)10 000g, 離心5 min, 棄上清液, -20℃保存?zhèn)溆?。解凍保存的微生物膜樣? 使用 3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2進行基因組總DNA的提取。

1.2.5 PCR 擴增

采用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)序列通用引物進行擴增, 引物為 357f-GC(5′-CGC CCG CCG C GC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)和 518r(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′), 擴增總體系為 50 μL: 模板DNA 2 μL, 4×dNTPs (10 μmol/L)1μL, Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)1 μL, 引物(20 pmol/μL)各 1.5 μL, 10×擴增緩沖液(含 Mg2+)5 μL, 用 ddH2O 補至 50 μL。PCR反應(yīng)在 Mastercycler gradient(eppendorf)上進行,PCR 擴增條件: 94℃預(yù)變性5 min, 20個循環(huán)的降落PCR(94℃變性1 min, 退火30 s, 72℃延伸3 min, 退火溫度由 65℃降到 55℃, 每一循環(huán)遞減 0.5℃), 15個循環(huán)(94℃變性1 min, 55℃退火30s, 72℃延伸3 min),72℃延伸10 min, 4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。

1.2.6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

使用 Bio-Rad 公司 D-code System 電泳儀進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分離。制備聚丙烯酰胺凝膠, 濃度為 8%, 變性梯度為 40%～70%(7 mol/L尿素和 40%去離子甲酰胺為 100%變性), 電泳緩沖液為1×TAE, 60℃, 60V條件下電泳10 h。電泳結(jié)束后, 用溴乙錠染色 15 min, 紫外拍照, 并采用軟件 Quantity one(Bio-rad)對DGGE圖譜進行多樣性指數(shù)分析。

1.2.7 稚貝附著實驗

將載有微生物膜的載玻片放入盛有 20 mL滅菌海水的培養(yǎng)皿(?64 mm × 19 mm)中, 每個培養(yǎng)皿中放入10只稚貝, 每個日齡設(shè)置5個平行組, 以空白載玻片作為對照。實驗溫度為(18 ± 1)℃, 黑暗條件。實驗12、24和48 h時, 記錄稚貝的附著率, 即載玻片上附著的稚貝個數(shù)占該培養(yǎng)皿中稚貝總數(shù)的百分比。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 低鹽度下形成的微生物膜對厚殼貽貝稚貝附著的影響

同一鹽度下, 微生物膜在12、24和48 h對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)基本相似, 因而本研究僅出示12 h的誘導(dǎo)效果, 其結(jié)果如圖1所示。與對照組(0 d)相比, 鹽度13和23時形成的微生物膜均能促進厚殼貽貝稚貝的附著(P＜ 0.05)。鹽度13時, 不同日齡的微生物膜對稚貝附著的誘導(dǎo)效果之間無顯著差異(P＞0.05), 21 d的微生物膜對稚貝附著的誘導(dǎo)達(dá)到最大,為50%。同樣, 鹽度23時, 不同日齡的微生物膜對稚貝誘導(dǎo)活性之間無顯著差異(P＞ 0.05), 在28d的微生物膜誘導(dǎo)下附著率達(dá)到最大, 為 72%。在高日齡(28 d)時, 兩者活性無顯著性差異(P＞ 0.05), 但隨著鹽度的增大, 稚貝附著率也隨之升高, 相關(guān)性分析表明微生物膜的誘導(dǎo)活性與鹽度顯著相關(guān)(P＜ 0.05, 表1)。低鹽條件下, 微生物膜的誘導(dǎo)稚貝附著率與干質(zhì)量顯著相關(guān)(P＜ 0.05)。同樣, 細(xì)菌密度(P＜ 0.05)和硅藻密度(P＜ 0.05)明顯與稚貝附著率呈顯著性相關(guān)關(guān)系(表1)。

圖1 低鹽度時形成的微生物膜對厚殼貽貝稚貝附著率的影響Fig. 1 Settlement rates of Mytilus coruscus plantigrades on biofilms formed on low salinities

表1 低鹽時, 微生物膜日齡及誘導(dǎo)稚貝附著率與干質(zhì)量、細(xì)菌密和硅藻密度間的相關(guān)性Tab. 1 Correlation between age or settlement (%)and dry weight, bacterial and diatom densities

2.2 微生物膜中的干質(zhì)量、細(xì)菌密度、硅藻密度與鹽度、日齡的關(guān)系

低鹽條件下, 微生物膜的干質(zhì)量、細(xì)菌和硅藻密度隨日齡變化如圖2所示。鹽度13時, 隨著日齡的增加, 干質(zhì)量逐漸增加, 在 28 d 達(dá)到最大值(P＜0.05, 圖2-A)。鹽度23時, 干質(zhì)量14 d時明顯增加(P＜ 0.05), 21 d和28 d雖有增加, 但無顯著性差異(P＞0.05)。低鹽條件下, 附著細(xì)菌密度均隨著日齡的增加呈顯著增加趨勢(P＜ 0.05), 28 d時達(dá)到最高, 分別為9.4 ×106± 1.7 × 106個/cm2和 11.1 × 106± 1.5 × 106個/cm2(圖2-B)。同樣, 鹽度13和23時形成微生物膜中的硅藻密度均隨著日齡增加呈明顯增加趨勢(P＜ 0.05,圖2-C)。低鹽條件下, 微生物膜干質(zhì)量、細(xì)菌和硅藻密度與日齡關(guān)系如表1所示。鹽度13和23時, 微生物膜的干質(zhì)量明顯與日齡呈顯著性相關(guān)(P＜ 0.05),其中的細(xì)菌(P＜ 0.05)和硅藻密度(P＜ 0.05)也與日齡顯著相關(guān), 其相關(guān)性系數(shù)均大于0.9。

2.3 低鹽條件下形成微生物膜中葉綠素 a含量變化

微生物膜中葉綠素a的含量, 在鹽度13時, 14 d與21 d葉綠素a含量之間無顯著差異(P＞ 0.05, 圖3),其他日齡間存在顯著差異(P＜ 0.05)。鹽度23、14 d時葉綠素a的含量達(dá)到最高值, 為2.03 μg/cm2, 21、28 d微生物膜中的葉綠素a含量之間無顯著性增加(P＞ 0.05)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), 鹽度13時形成的微生物膜其日齡與葉綠素a無顯著的正相關(guān)性(P＞ 0.05)。同樣, 鹽度23時形成的微生物膜, 其日齡與葉綠素a無正相關(guān)性(P＞ 0.05)。

2.4 微生物膜中細(xì)菌群落多樣性分析

圖2 低鹽時形成的微生物膜中的干質(zhì)量(A)、細(xì)菌密度(B)和硅藻密度(C)Fig. 2 Dry weight(A), bacterial density(B)and diatom density(C)of biofilms formed on low salinities

圖3 低鹽時形成微生物膜中的葉綠素a含量變化Fig. 3 Chlorophyll a content in biofilms formed on low salinities

不同鹽度、日齡下微生物膜中細(xì)菌DGGE指紋圖譜如圖4所示。DGGE圖譜中條帶的數(shù)量可以反映樣品的細(xì)菌多樣性, 條帶信號的強弱可以反映細(xì)菌的相對含量, 通過軟件Bio-rad Quantity one 4.6.2分析每個樣品的條帶數(shù)目和亮度, 研究低鹽條件下、日齡的微生物膜中細(xì)菌的種類數(shù)量和相對含量,得出微生物膜中細(xì)菌多樣性信息(表2)。由表2可知,在不同的鹽度下, 隨著日齡的增加, 微生物膜中細(xì)菌 DGGE圖譜的條帶數(shù)有所增加, 其中鹽度 13時最為明顯。同時, 低鹽度條件下, 微生物膜中的細(xì)菌多樣性指數(shù)隨著日齡的增加不斷上升, 在 28 d時細(xì)菌多樣性指數(shù)均達(dá)到最高, 分別為 1.98和2.27。在 DGGE指紋圖譜基礎(chǔ), 開展了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的聚類分析, 其結(jié)果如圖 5所示。研究發(fā)現(xiàn), 鹽度13時, 7 d 微生物膜與14 d微生物膜的相似性很高為64%, 21 d 微生物膜與28 d微生物膜的相似性很高為59%。鹽度23時, 21 d微生物膜與28 d微生物膜的相似性很高為62%, 這2個日齡微生物膜與14 d 和 7 d 的微生物膜的相似性分別為 58%和50%。

圖4 低鹽條件下, 不同日齡微生物膜樣品DGGE指紋圖譜Fig. 4 DGGE fingerprints of biofilms formed on low salinities

表2 低鹽時形成微生物膜中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Tab.2 Analysis of bacterial community diversity in biofilms formed on low salinities

圖5 低鹽時形成微生物膜中的細(xì)菌DGGE指紋圖譜的聚類分析Fig. 5 Dendrogram generated from the DGGE profiles

3 討論

本研究首次證明鹽度影響微生物膜形成過程中的生物構(gòu)成、群落結(jié)構(gòu), 從而影響其對厚殼貽貝稚貝的附著率也隨之升高, 微生物膜的誘導(dǎo)活性與鹽度呈顯著相關(guān)。因而, 鹽度不僅是海洋無脊椎動物生存的一個重要環(huán)境因子, 而且也是影響海洋無脊椎幼體附著和變態(tài)的物理因子[15]。

目前的研究發(fā)現(xiàn), 在單一鹽度條件下, 厚殼貽貝稚貝在微生物膜表面的附著率無顯著性差異, 但隨微生物膜日齡的增長而呈逐漸增加的趨勢, 這與以往微生物膜對厚殼貽貝幼體附著的研究結(jié)果一致[13]。然而, 雜色鮑的研究中發(fā)現(xiàn)其幼蟲的附著變態(tài)并不隨著微生物膜日齡的增加而增加[12], 這有可能與研究的物種不同而有區(qū)別。另外, 低鹽時所形成微生物膜其日齡與均與微生物膜的干質(zhì)量、細(xì)菌密度和硅藻密度存在顯著的正相關(guān)性, 而與所含的葉綠素 a卻不存在顯著性相關(guān)。同樣, 在海域形成的自然微生物膜研究中發(fā)現(xiàn), 其日齡與微生物膜的干重、細(xì)菌密度和硅藻密度顯著相關(guān), 而與所含的葉綠素 a含量無相關(guān)性。因而, 表明鹽度盡管引起微生物膜形成過程中的生物量的變化, 但在同一鹽度時對生物量與日齡的兩者之間關(guān)系無顯著性影響。

本實驗結(jié)果表明, 不同鹽度、日齡下微生物膜誘導(dǎo)厚殼貽貝稚貝的附著率與微生物膜的硅藻密度存在顯著的正相關(guān)性。在鹽度23時, 28 d的微生物膜下稚貝的附著率最高。硅藻作為許多經(jīng)濟貝類幼體的主要餌料, 能夠為貝類的幼體及其稚貝附著過程中提供充足的餌料, 同時也有可能參與厚殼貽貝稚貝的附著過程, 且釋放出一些化學(xué)信號物質(zhì), 促進了稚貝的附著, 如硅藻的胞外聚合物。然而, 這需要進一步的研究來證實這種假說。此外, 很多研究表明,海洋細(xì)菌會對多毛類[16]、棘皮動物[17]、腔腸動物[18]、軟體動物[19]、甲殼類[20]、苔蘚動物[21]和海鞘[22]等諸多海洋無脊椎動物的浮游幼體的附著變態(tài)產(chǎn)生顯著影響。本實驗結(jié)果表明, 厚殼貽貝稚貝的附著率與組成微生物膜的細(xì)菌密度存在顯著的正相關(guān)性, 隨著細(xì)菌密度的增加, 附著率也隨之增加, 表明細(xì)菌對厚殼貽貝稚貝的附著產(chǎn)生了相應(yīng)的影響, 但是細(xì)菌是如何影響稚貝附著以及是否與誘導(dǎo)厚殼貽貝幼體附著的方式一樣仍需進一步的研究。

微生物膜作為一個微型生物群落, 在不同的鹽度下, 其生物群落的組成和生物數(shù)量也不相同。葉綠素 a作為一類特殊的色素, 是藻類細(xì)胞重要組成部分, 在一定程度上可以反映出微生物膜中能進行光合作用生物的現(xiàn)存量。目前結(jié)果表明, 微生物膜的誘導(dǎo)活性與葉綠素 a之間無顯著相關(guān)性, 因而微生物膜中的能進行光合作用生物與稚貝附著可能無必然聯(lián)系性。通過采用 DGGE指紋圖譜技術(shù), 對微生物膜中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn), 在不同的鹽度時,微生物膜中所含細(xì)菌種類數(shù)量和相對含量有所不同。分析發(fā)現(xiàn), 7～21 d日齡范圍, 鹽度13時的DGGE圖譜條帶數(shù)與相對較高鹽度時的條帶數(shù)相近, 而在28d日齡、鹽度13時的DGGE圖譜條帶數(shù)明顯低于相對較高鹽度時的條帶數(shù)。同樣, 28 d日齡微生物膜中的細(xì)菌多樣性指數(shù)也在鹽度23時相對較高, 表明鹽度影響且參與調(diào)控微生物膜形成過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。然而, 究竟何種菌屬在整體細(xì)菌群落中發(fā)揮主導(dǎo)作用仍需進一步的研究。

總之, 微生物膜的形成受海域環(huán)境中的鹽度變化影響而發(fā)生不斷群落演替, 不同鹽度形成的微生物膜對厚殼貽貝稚貝的附著行為產(chǎn)生影響。因而, 在貽貝稚貝的附著基的選擇過程中, 鹽度應(yīng)作為一個重要因素考慮進來。本研究成果為今后貝類中間培育技術(shù)的改善提供了重要科學(xué)依據(jù), 同時對于厚殼貽貝稚貝的附著機制的理解具有重要的理論意義。

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