馬銀鵬，王玉文，黨阿麗，孔祥輝，2，張介馳，2

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010;2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150020)

大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)系統(tǒng)由于其具有遺傳背景和生化特性清楚、成本低廉、操作簡便、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點最早被采用作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)。但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺少真核生物的蛋白翻譯后進(jìn)行加工和修飾的功能，表達(dá)的蛋白大部分以包含體形式存在，且需要經(jīng)過復(fù)雜的復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象和活性以及背景雜蛋白較多[1］，為克服這些缺點，人們于1979年開發(fā)了酵母表達(dá)系統(tǒng)。

酵母是單細(xì)胞低等真核生物，既具有原核生物細(xì)胞生長速度快、容易培養(yǎng)、操作簡單等優(yōu)點，又具有真核生物表達(dá)時對蛋白質(zhì)的加工和修飾等功能。因此相對于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的不具有活性的蛋白，酵母表達(dá)出的蛋白是具有生物學(xué)活性的，而且酵母表達(dá)系統(tǒng)比其他真核表達(dá)系統(tǒng)如昆蟲、哺乳動物組織等表達(dá)系統(tǒng)快速、簡便、成本低[2］。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最早被用作酵母表達(dá)系統(tǒng)的宿主。1981年Hitzeman等用它成功表達(dá)了人干擾素基因[3］。第一個商品化的重組疫苗也是由釀酒酵母表達(dá)的[4］。釀酒酵母全基因組于1996年測序完成，更多的蛋白如乙肝表面抗原、人胰島素、人血清蛋白和降鈣素等通過其成功表達(dá)[5］。由于其具有難以高密度培養(yǎng)，缺乏強有力的啟動子，分泌效率低等局限性[1，6］，因此人們在此基礎(chǔ)上又尋找了新的酵母表達(dá)系統(tǒng)宿主——畢赤酵母(Pichia pastoris)[7］。

1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點

畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，以甲醇為唯一的碳源和能源[8］。畢赤酵母具有強有力的醇氧化酶基因AOX啟動子，是目前最強、調(diào)控機(jī)制最嚴(yán)格的啟動子之一。它能夠嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá)，使外源基因只在含有甲醇的培養(yǎng)基中有效表達(dá)。基因組中存在兩個基因AOX1和AOX2，對AOX基因進(jìn)行編碼，兩個基因的同源性為92%，編碼蛋白質(zhì)的同源性高達(dá)97%。AOX1啟動子受到甲醇的誘導(dǎo)強烈，但是AOX2啟動子受甲醇誘導(dǎo)較弱[9］。一般情況下外源基因整合到畢赤酵母染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，不易丟失，遺傳性狀穩(wěn)定。畢赤酵母在氧氣充足時能快速生長，通過連續(xù)培養(yǎng)可形成很高的細(xì)胞密度。因此，畢赤酵母可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)[10］。在1993年，RCT(Research Corporation Technologies)允許畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)用于學(xué)術(shù)研究，這使該系統(tǒng)的知識庫呈現(xiàn)了爆炸性增長[2］。

2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的組成

2.1 表達(dá)宿主

目前利用的畢赤酵母表達(dá)宿主是由野生菌株NRRLY 11430(Northern Regional Research Laboratories， IL，USA)改良的。常用的畢赤酵母菌株有組氨酸缺陷型、腺嘌呤缺陷型和蛋白酶缺陷型。所有菌株均屬于組氨酸缺陷型，這類菌株只能在含有組氨酸的培養(yǎng)基中生長，這有助于在無組氨酸的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化成功含有組氨酸質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子[7］。PMAD11和 PMAD16屬于腺嘌呤缺陷型。SMD1163、SMD1165和SMD1168為蛋白酶缺陷型，基因組中缺失編碼蛋白酶A(pep4)或編碼蛋白酶B(prb1)的基因，減弱了蛋白酶對外源蛋白的降解作用，為外源基因的高效表達(dá)提供了一個穩(wěn)定的環(huán)境，適用于分泌型表達(dá)。由于畢赤酵母中1個或2個AOX基因的缺失，造成其對甲醇的利用能力不同，畢赤酵母菌株分為3種表現(xiàn)型。GS115、SMD1163、SMD1165和SMD1168菌株含有完整的AOX1和AOX2，在甲醇為唯一碳源時，強烈誘導(dǎo)啟動子使外源基因大量表達(dá)，為甲醇快速利用型Mut+。其中以GS115應(yīng)用最廣泛。KM71菌株無AOX1但是有AOX2，利用甲醇效率較低，為甲醇慢速利用型Muts。MC100－3菌株中的AOX1和AOX2均被敲除，不能利用甲醇，為甲醇不能利用型Mut－。常見畢赤酵母菌株、基因型和表現(xiàn)型如表1所示:

表1 畢赤酵母表達(dá)菌株Tab.1 The host strains of P.pastoris expression system

2.2 表達(dá)載體

畢赤酵母中沒有穩(wěn)定的天然質(zhì)粒，通常利用整合型穿梭質(zhì)粒作為外源基因的表達(dá)載體。攜帶外源基因的表達(dá)載體先在大腸桿菌中復(fù)制擴(kuò)增，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞中與酵母細(xì)胞染色體基因組整合，表達(dá)外源蛋白。典型的畢赤酵母表達(dá)載體含5'AOX1啟動子、3'AOX1終止子、his4營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志、多克隆位點、大腸桿菌Ampr和ori序列[1］。

畢赤酵母表達(dá)載體中沒有酵母復(fù)制起點，它依靠AOX1或HIS4基因的位置同源重組整合進(jìn)入酵母染色體中。質(zhì)粒整合到畢赤酵母染色體有單一交叉插入和雙交換兩種方式。含有外源基因的載體通過單交換方式插入宿主染色體的HIS4位點或AOX1的上游或下游，AOX1基因仍能正常表達(dá)，得到的多拷貝的轉(zhuǎn)化子，表型為Mut+。含有外源基因的載體通過雙交換方式插入到染色體AOX1基因位點，不能正常表達(dá)AOX1基因，但是可以表達(dá)AOX2基因，形成的單拷貝轉(zhuǎn)化子，表型為Muts。

載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中的方式包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇法和氯化鋰法。其中原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和氯化鋰法轉(zhuǎn)化效率較高[11］。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法易形成高拷貝數(shù)，但是步驟較煩瑣，且易污染。電轉(zhuǎn)化法操作簡便，不易污染，現(xiàn)已廣泛使用。其他兩種方法轉(zhuǎn)化效率較低[12］。

2.2.1 啟動子

畢赤酵母中最常用的表達(dá)外源蛋白的啟動子是醇氧化酶基因啟動子(PAOX1)。Yu[13］利用 PAOX1啟動子在畢赤酵母GS115中成功表達(dá)了超氧化物歧化酶，表達(dá)的蛋白具有免疫學(xué)活性和酶活性。Ghaffar等[14］也利用該啟動子在畢赤酵母GS115中成功表達(dá)了來自嗜熱毛殼菌的耐熱木聚糖酶，培養(yǎng)96 h后的最大胞外酶活性達(dá)15.6 U/mL。但是該啟動子也存在一定的缺陷，如甲醇有毒、易揮發(fā)，誘導(dǎo)時需連續(xù)添加甲醇，不適用于食品生產(chǎn)，大量甲醇積累可能會引發(fā)火災(zāi)。3－磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(PGAP)經(jīng)葡萄糖誘導(dǎo)能提供與PAOX1啟動子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平，而且培養(yǎng)過程中不需要更換碳源。Vellanki等[15］利用PGAP啟動子成功地在畢赤酵母中表達(dá)了乙肝表面抗原。Yang等[16］也利用該啟動子在畢赤酵母中表達(dá)了－淀粉酶。但是PGAP啟動子不適用于表達(dá)對酵母有毒性作用的蛋白。谷胱甘肽依賴性甲醛脫氫酶基因(FLD1)編碼畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)途徑中的一種關(guān)鍵酶，該基因可被甲醇和甲胺誘導(dǎo)表達(dá)，也可被用作畢赤酵母啟動子(PFLD1)。當(dāng)利用甲胺誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)時，可以利用葡萄糖或甘露糖取代甲醇作為碳源，或者甲醇既是碳源又是誘導(dǎo)劑[17］。

2.2.2 選擇標(biāo)記

表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記基因可用于篩選陽性轉(zhuǎn)化子和高拷貝轉(zhuǎn)化子。營養(yǎng)缺陷型基因如HIS4、SUC2、ARG4等已經(jīng)被用來連接到營養(yǎng)缺陷型的宿主菌株上，用于篩選陽性轉(zhuǎn)化子?？股乜剐曰蛉鏩eocin、Kanr等都能在畢赤酵母中表達(dá)，常用于篩選高拷貝的陽性轉(zhuǎn)化子。一般是先篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，然后再篩選出高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子。

2.2.3 信號肽

畢赤酵母表達(dá)的外源蛋白可通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩種方式表達(dá)。細(xì)胞外表達(dá)外源蛋白優(yōu)于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，由于畢赤酵母分泌很少的自身蛋白，而細(xì)胞外表達(dá)可避免從細(xì)胞內(nèi)分離蛋白，且培養(yǎng)基中不需要添加蛋白質(zhì)，因此在培養(yǎng)基中分泌蛋白占大部分，有利于對外源蛋白的分離純化。將外源蛋白分泌到細(xì)胞外需要在表達(dá)載體上添加信號肽序列鏈接到分泌途徑。目前應(yīng)用較成功的信號肽有釀酒酵母交配因子信號肽、酸性磷酸酶信號肽、蔗糖酶信號肽等。釀酒酵母交配因子信號肽是目前應(yīng)用最廣泛也是最成功的信號肽，在一些情況下優(yōu)于外源蛋白的前導(dǎo)序列，但是利用該因子作為外源蛋白的信號肽有時會使N末端氨基酸序列發(fā)生變異。

3 外源基因表達(dá)的影響因素

畢赤酵母中外源基因的表達(dá)受到多種因素的影響，主要包括外源基因的性質(zhì)和畢赤酵母培養(yǎng)條件兩個方面。外源基因的性質(zhì)主要包括UTR序列、A+T含量、密碼子和基因拷貝數(shù)等。畢赤酵母培養(yǎng)條件主要包括培養(yǎng)基、溫度、pH值、通氣和甲醇誘導(dǎo)等。研究發(fā)現(xiàn)可以通過改變外源基因的性質(zhì)和優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因在畢赤酵母中高效表達(dá)。

3.1 外源基因的性質(zhì)

3.1.1 UTR 序列

mRAN 5'和3'非翻譯區(qū)(UTR)的長度和序列可能影響外源基因的表達(dá)。UTR太長或太短都會造成核糖體40S亞單位的識別障礙，影響外源基因的表達(dá)。適當(dāng)長度的5'UTR能夠極大促進(jìn)mRNA的高效表達(dá)。

3.1.2 A+T 含量

在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，局部A+T含量過高會使外源基因表達(dá)提前終止?？赡苁且驗锳+T含量豐富的區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄提前終止信號，使外源基因不能有效轉(zhuǎn)錄，因此外源基因中A+T含量影響外源基因的表達(dá)量。對A+T含量豐富的基因應(yīng)利用畢赤酵母外源基因表達(dá)序列的優(yōu)化軟件重新設(shè)計序列，使A+T含量控制在30% ～55%理論范圍內(nèi)。優(yōu)化軟件綜合考慮密碼子的使用頻率和A+T含量因素，優(yōu)化后的序列與AOX1存在相似的特性，因此可使外源基因高效表達(dá)[18］。Gurkan等[19］使用外源基因表達(dá)序列優(yōu)化軟件重新設(shè)計外源基因的序列，A+T含量由70%降到50%，可使畢赤酵母高效表達(dá)細(xì)菌毒素及其衍生產(chǎn)物。

3.1.3 密碼子

外源基因中的密碼子影響外源基因的表達(dá)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對密碼子具有偏愛性，使用畢赤酵母偏愛的密碼子可使外源基因高效表達(dá)。通過對酵母基因使用密碼子的統(tǒng)計分析，確認(rèn)了61個密碼子中有25個密碼子是酵母所偏愛的[20］。張朝春等[21］根據(jù)人神經(jīng)營養(yǎng)素的基因序列，把編碼氨基酸的密碼子轉(zhuǎn)換成畢赤酵母偏愛的密碼子，結(jié)果表明使用偏愛密碼子的基因在畢赤酵母菌株中的表達(dá)明顯優(yōu)越于對照組表達(dá)量，在誘導(dǎo)后72～96 h最高，達(dá)到31 mg/L左右。Li等[22］根據(jù)外源基因?qū)γ艽a子的偏好性，對硫色曲霉的內(nèi)切β－1，4－木聚糖酶基因改造，表達(dá)產(chǎn)量為105 U/mL，是未改造外源基因表達(dá)產(chǎn)量的5倍。

3.1.4 基因拷貝數(shù)

基因拷貝數(shù)影響外源蛋白的表達(dá)量。多拷貝基因通?？梢蕴岣咄庠椿虻谋磉_(dá)量，外源基因的拷貝數(shù)越多，外源蛋白的表達(dá)量也就越高。利用畢赤酵母表達(dá)肝炎B表面抗原(HbsAg)時發(fā)現(xiàn)，包含4個基因拷貝的菌株的表達(dá)量是單拷貝菌株表達(dá)量的4倍，而且對于轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響[23］。Li等[24］增加畢赤酵母中的脂肪酸去飽和酶與延長酶基因的拷貝數(shù)，提高花生四烯酸和十二碳五烯酸產(chǎn)物的含量。然而有時增加外源基因的拷貝數(shù)有可能會降低蛋白的表達(dá)量。由于資源和能量的限制，增加基因拷貝數(shù)可能對轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生影響，這也會限制外源蛋白的表達(dá)。還可能是由于高拷貝使菌株穩(wěn)定性減弱，也可能與外源基因自身特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)。對于分泌效率低的蛋白，過高的表達(dá)對畢赤酵母分泌途徑產(chǎn)生負(fù)反饋抑制作用，不利于外源蛋白的表達(dá)。因此在選擇表達(dá)菌株時不能僅僅追求高拷貝數(shù)，應(yīng)以蛋白表達(dá)量為最終的標(biāo)準(zhǔn)篩選高表達(dá)菌株。

3.2 培養(yǎng)條件

3.2.1 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為酵母細(xì)胞生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，在培養(yǎng)基中添加適量的酪蛋白氨基酸和蛋白胨等，能夠緩解蛋白酶對外源蛋白的水解作用，同時提供蛋白合成和分泌的原料和能量，有利于增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性，提高外源蛋白的表達(dá)量。這些物質(zhì)可能是通過替代或競爭蛋白酶起作用，抑制蛋白酶的活性[25］。在培養(yǎng)基中添加一些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)，如含有金屬的酶、金屬元素等，能提高一些特殊蛋白的表達(dá)水平。在培養(yǎng)基中加入特異的蛋白酶抑制劑能很好地抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的表達(dá)。Shi等[26］在培養(yǎng)基中加入絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)蛋白酶活性分別降低了53%和30%。

3.2.2 溫度

畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的適宜溫度為28℃～30℃，在此溫度范圍畢赤酵母細(xì)胞生長速度最快，理論上外源蛋白的表達(dá)量與菌體密度呈正相關(guān)性。畢赤酵母表達(dá)外源蛋白時會產(chǎn)生大量的熱量，當(dāng)溫度超過32℃時，外源蛋白的表達(dá)會停止。因此，畢赤酵母表達(dá)過程中要控制合適的溫度。研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母在較低溫度下有利于外源蛋白的表達(dá)，可能是外源蛋白在較高溫度下的穩(wěn)定性下降，不利于蛋白質(zhì)折疊，也可能是死細(xì)胞釋放更多的蛋白酶降解外源蛋白[27］。Li等[28］用畢赤酵母表達(dá)鯡魚防凍蛋白時發(fā)現(xiàn)，低溫顯著增加了外源蛋白的表達(dá)量，可能是由于低溫條件下增強了蛋白折疊通路和細(xì)胞生存能力。

3.2.3 pH 值

畢赤酵母能夠在一個較寬的pH值范圍內(nèi)生長(3.0～7.0)。pH值通過影響蛋白酶活性，改變蛋白酶對外源蛋白的降解作用，來影響外源蛋白的表達(dá)量和活性。不同的外源蛋白穩(wěn)定表達(dá)需要不同pH值。重組的小鼠表皮因子和人血清蛋白表達(dá)的最適pH值為6.0[29］，而類胰島素生長因子Ⅰ在pH值為3.0時表達(dá)效果最佳。

3.2.4 通氣

畢赤酵母利用甲醇表達(dá)外源蛋白時需要消耗大量的氧氣，溶氧不足會抑制菌體繁殖和外源蛋白的表達(dá)，并且造成甲醇及次級代謝產(chǎn)物甲醛和過氧化氫的積累，對酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，因此充足的通氣量對畢赤酵母外源蛋白的表達(dá)極其重要。

3.2.5 甲醇誘導(dǎo)

甲醇是酵母表達(dá)的誘導(dǎo)物和唯一的碳源。在甲醇誘導(dǎo)期間，由于甲醇的消耗和揮發(fā)，應(yīng)及時向培養(yǎng)基中連續(xù)補加甲醇。甲醇濃度太高對畢赤酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒害，濃度太低則誘導(dǎo)表達(dá)的外源蛋白太少。一般甲醇的添加量為培養(yǎng)基體積的0.5% ～1%。

甲醇誘導(dǎo)時間也影響外源基因的表達(dá)量。誘導(dǎo)時間太短則表達(dá)的外源蛋白量少，誘導(dǎo)時間太長外源蛋白容易被蛋白酶降解，外源蛋白的表達(dá)量少。因此應(yīng)根據(jù)載體的特點和外源蛋白的性質(zhì)選擇最合適的誘導(dǎo)時間，誘導(dǎo)產(chǎn)生最大量的外源蛋白。

4 結(jié)論

利用畢赤酵母表達(dá)外源蛋白是很高效的，通過利用高效的啟動子、分泌信號、抑制蛋白酶活性和發(fā)酵控制等，研究者們已經(jīng)實現(xiàn)了很多外源蛋白的高效表達(dá)。一定程度的流程優(yōu)化，有助于產(chǎn)生最大量和最高活性的外源蛋白，而外源蛋白的產(chǎn)量和活性很大程度上依賴培養(yǎng)的參數(shù)，這些可以通過條件控制來滿足[10］。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)相對于大腸桿菌、釀酒酵母、昆蟲細(xì)胞等，是最簡單和最可靠的外源基因表達(dá)系統(tǒng)[10］，現(xiàn)已經(jīng)成功表達(dá)了細(xì)菌、真菌、病毒、植物、動物以及人類方面的相關(guān)蛋白質(zhì)[30］。過去幾十年來，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在很多外源蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)中已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。但是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)還存在一些不足之處，外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)和高效表達(dá)還需要更多的研究去認(rèn)識，表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能還需要進(jìn)一步的研究。但是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究會更加深入，有理由推測畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)將會有更大的發(fā)展和應(yīng)用空間。

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