賀瑩瑩，徐小琳，王思雨，王長(zhǎng)海，代斌

（1石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院／新疆兵團(tuán)化工綠色過(guò)程重點(diǎn)試驗(yàn)室／省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，石河子832003；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京210095）

微藻種類多，生長(zhǎng)速度快，周期短，不占用耕地，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，能夠進(jìn)行光合自養(yǎng)并且合成許多結(jié)構(gòu)和生理功能獨(dú)特的生物活性物質(zhì)［1－4］，如多糖、蛋白質(zhì)、色素及不飽和脂肪酸等。微藻多糖具有較強(qiáng)的抗氧化、抗病毒及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等活性［5－7］，已經(jīng)成為藥物研究的重點(diǎn)。

目前，熱水浸提工藝［8－13］被廣泛應(yīng)用于多糖的提取，但此法通常提取溫度較高、提取時(shí)間較長(zhǎng)并且提取效率低下。胡仲秋等［14］采用堿液提取枸杞多糖（LBP），在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該工藝下LBP得率可達(dá)7．46%，比傳統(tǒng)水提工藝提高1．59%；Pengrong Wang等［15］采用堿提工藝優(yōu)化Monascus mycelium 多糖的提取，多糖得率較傳統(tǒng)水提方法提高2．10倍，并且堿提多糖清除O2－和DPPH自由基的能力與水提多糖相近。由于微藻中含有部分酸性多糖，因此本實(shí)驗(yàn)擬選取堿液提取微藻多糖。多糖提取工藝多為單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)［16－19］，采用固定其他因素，改變一個(gè)因素的單因素考察法確定工藝條件，不能考察因素之間的相互作用，同時(shí)也很難考察多個(gè)響應(yīng)值與因素之間的交互作用關(guān)系。為了提高多糖的提取效率，采用模型擬合過(guò)程更能系統(tǒng)地優(yōu)化提取工藝。響應(yīng)面法［20－23］已被成功應(yīng)用于微生物培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件和活性成分提取等工藝的優(yōu)化，它是通過(guò)擬合模型優(yōu)化過(guò)程設(shè)置來(lái)分析互作效應(yīng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，由此能反映出單因素和多種因素間的交互作用，因此被認(rèn)為是較為準(zhǔn)確可靠的優(yōu)化方法。

從新疆石河子市北湖分離得到的斜生柵藻（Scnedesmus obliquus）與實(shí)驗(yàn)室另外3株微藻相比，其生物量和多糖含量都相對(duì)較高，且該藻株在穩(wěn)定期能大量自絮凝，使藻體與培養(yǎng)液分離，有利于藻體的后續(xù)大規(guī)模采收。因此，本文實(shí)驗(yàn)選用斜生柵藻的干藻粉為原料，利用單因素實(shí)驗(yàn)考察堿液濃度、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)其多糖提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取參數(shù)，得到堿提斜生柵藻多糖的最佳工藝條件，為進(jìn)一步研究斜生柵藻多糖的活性奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1．1 材料

1．1．1 供試藻株及培養(yǎng)條件

斜生柵藻（Scnedesmus obliquus）分離于新疆石河子北湖，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為斜生柵藻，保藏于新疆兵團(tuán)化工綠色過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。將斜生柵藻藻種接種于改良BG11培養(yǎng)基中，置于自制光照培養(yǎng)架上，培養(yǎng)條件為：溫度（24．0±2．0）℃，光照條件4000lx，連續(xù)光照，每天定時(shí)搖瓶3次并交換位置，確保微藻藻液均勻光照，避免長(zhǎng)時(shí)間靜置。藻液培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，離心收獲，經(jīng)蒸餾水洗滌2次，冷凍干燥機(jī)干燥，保存于干燥器中，待用。

1．1．2 試劑及儀器

無(wú)水乙醇、濃硫酸、蒽酮和葡萄糖等其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。LXJ－IIB低速大容量多管離心機(jī)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；FA1104B電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；PK－8D電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GZX－9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ALPHR 1－2LD 冷凍干燥儀，德國(guó)Christ公司；V－1100D型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1．1．3 培養(yǎng)基

改 良 的 BG11 培 養(yǎng) 基：NaNO30．004g／L，K2HPO4·3H2O 0．240g／L，MgSO4·7H2O 0．212 g／L，CaCl2·H2O 0．036g／L，檸檬酸0．006g／L，檸檬酸鐵銨0．024g／L，EDTA Na20．001g／L，Na2CO30．020g／L，NaHCO31．424g／L和1mL／dL的微量元素溶液。微量元素溶液包含：H3BO32．860g／L，MnCl4·H2O 1．860g／L，ZnSO4·7H2O 0．220g／L，NaMoO4·2H2O 0．390g／L，CuSO4·5H2O 0．080 g／L和Co（NO3）2·6H2O 0．050g／L。

1．2 方法

1．2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用蒽酮－硫酸法［24］以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取100mg 105℃恒重的葡萄糖（分析純），溶解并用蒸餾水定容至100mL，分別取出1、2、3、4、5mL加入到50mL的容量瓶中，配成濃度為20、40、60、80、100μg·mL－1的溶液。各取1 mL于20mL具塞試管中，再加入4mL的蒽酮試劑，待幾支試管均加完后，同時(shí)浸入100℃恒溫水浴箱中，準(zhǔn)確保溫10min后取出，立即用流動(dòng)水冷卻。于室溫下平衡約5min左右，以1mL的蒸餾水為空白，在波長(zhǎng)620nm處測(cè)定吸光度。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝0．0069C＋0．0025，相關(guān)系數(shù)R2＝0．9991。

1．2．2 多糖的提取工藝及提取率計(jì)算

準(zhǔn)確稱取斜生柵藻干藻粉50．0mg，加入5mL不同濃度的堿液，于超聲波清洗儀超聲混勻10min后置于電熱恒溫水槽中，在設(shè)定的溫度下反應(yīng)一定的時(shí)間后離心，向上清液中加入3倍體積95%的乙醇，置于4℃冰箱中沉淀過(guò)夜后離心，將沉淀復(fù)溶于蒸餾水中，定容至100mL，取1mL利用蒽酮比色法測(cè)定其多糖含量，并計(jì)算多糖提取率。多糖提取率用式（1）計(jì)算：

其中：C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的多糖的濃度，μg／mL；V表示多糖提取液定容后的總體積，mL；W表示實(shí)驗(yàn)樣品的重量，mg。

1．3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box－Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化斜生微藻多糖的提取工藝。令多糖提取率為響應(yīng)值，采用 Design－Expert（v．7．1．6，Stat－Ease，Inc，Minneapolis，USA）軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，并建立回歸模型。采用多項(xiàng)式回歸分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二次多項(xiàng)式為：

式（2）中：Y 是響應(yīng)值；A0是常數(shù)；Ai，Aii和Aij分別代表一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互作項(xiàng)的回歸系數(shù)；Xi和Xj是自變量的水平。

2 結(jié)果與討論

2．1 單因素實(shí)驗(yàn)

影響微藻多糖提取率的因素較多，其中堿液濃度、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素影響較為顯著。本研究先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)因素與水平，再進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2．1．1 堿液濃度對(duì)斜生柵藻多糖提取率的影響

綠藻中含有部分酸性多糖，它們隨著提取液堿性的增強(qiáng)，更易被溶出；另外，以非共價(jià)鍵形態(tài)結(jié)合在一起的多糖與蛋白質(zhì)等物質(zhì)在堿性條件下更易解離，因而多糖易被釋放出來(lái)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用堿液對(duì)斜生柵藻多糖進(jìn)行提取。固定堿液浸提溫度為80．0℃，提取時(shí)間為2．0h，設(shè)定堿液質(zhì)量濃度分別為0、0．025、0．075、0．125、0．175、0．225mol／L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 堿液濃度對(duì)斜生柵藻多糖提取率的影響Fig．1Effect of alkali concentration on extraction yield of polysaccharides from Scnedesmus obliquus

由圖1可知：在一定溫度下，加入堿液可以顯著提高多糖的提取率，但當(dāng)堿液質(zhì)量濃度超過(guò)0．175 mol／L后，多糖提取率增加不明顯，并且堿液濃度過(guò)高，多糖因降解而使得率下降。綜上所述，堿液質(zhì)量濃度選取在0．175mol／L較為合適。

2．1．2 提取溫度對(duì)斜生柵藻多糖提取率的影響

固定堿液濃度為0．175mol／L，提取時(shí)間為2．0 h，設(shè)定水浸提溫度分別為50．0、60．0、70．0、80．0、90．0、100℃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知：隨著溫度升高，多糖提取率增加顯著，但升高至90．0℃之后，多糖提取率有下降趨勢(shì)，其原因可能與多糖本身的穩(wěn)定性有關(guān)。在堿液提取時(shí)，較高溫度可能破壞多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其提取率下降。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，提取溫度在80．0℃左右比較合適。

圖2 提取溫度對(duì)斜生柵藻多糖提取率的影響Fig．2Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides from Scnedesmus obliquus

2．1．3 提取時(shí)間對(duì)斜生柵藻多糖提取率的影響

提取時(shí)間是影響微藻多糖提取效率另一個(gè)較重要的因素。固定堿液質(zhì)量濃度為0．175mol／L，提取溫度為80．0℃，設(shè)定堿液浸提時(shí)間分別為0．50、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)斜生柵藻多糖提取率的影響Fig．3Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from Scnedesmus obliquus

2．2 中心組合實(shí)驗(yàn)（BBD）

2．2．1 Box－Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

影響微藻多糖提取率的因素并不是孤立發(fā)生作用的，它們之間共同發(fā)生作用才最終影響微藻多糖的提取率，因此，下面采用Box－Benhnken中心組合設(shè)計(jì)，以堿液質(zhì)量濃度、提取溫度和提取時(shí)間為自變量，分別以X1、X2和X3表示，以斜生柵藻多糖提取率為因變量，即響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平相應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)，分別用－1、0、1表示三水平的高、中、低水平。具體編碼水平如表1所示，中心組合實(shí)驗(yàn)方案及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 Box－Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素及水平Tab．1Variables and levels in response surface design

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab．2Experimental design and results of response surface methodology

通過(guò) Design Expert 7．1．6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得出堿提斜生柵藻多糖提取率的二階模型，方程如下：

式（3）中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗(yàn)來(lái)判定，p值越小，則相應(yīng)變量的響應(yīng)程度就越高。

由表3可知：上述模型可描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，模型p＜0．001，表明該回歸模型極其顯著；失擬項(xiàng)p為0．6918，不顯著；相關(guān)系數(shù)R2＝0．9890，說(shuō)明該模型擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差較?。籖2Adj為0．9749，表明上述模型可以解釋97．49%響應(yīng)值的變化。綜上所述，此模型可分析和預(yù)測(cè)斜生柵藻多糖提取率。此外，各因素中一次項(xiàng)X1、X2、X3以及二次項(xiàng)X12和X22為極顯著，因此，各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表3 斜生柵藻多糖提取預(yù)測(cè)回歸模型的方差分析Tab．3Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

2．2．2 影響斜生柵藻多糖提取率的因素分析

響應(yīng)面法的優(yōu)勢(shì)在于可以高效地確定自變量的最優(yōu)值，使得響應(yīng)值最大化。各個(gè)因素及其交互作用對(duì)斜生柵藻多糖提取率的影響結(jié)果可通過(guò)響應(yīng)面圖和等高線圖直觀的反映出來(lái)，本實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖4至6。

由圖4至6可知：提取堿液質(zhì)量濃度對(duì)斜生柵藻多糖得率的影響最大，隨著溫度的增加，多糖得率也隨之增加，若提取溫度超過(guò)80．0℃，多糖得率反而會(huì)降低；提取時(shí)間對(duì)多糖得率也有一定的影響，但時(shí)間的增加對(duì)多糖得率影響較小，從節(jié)省成本和能耗的角度考慮，增加提取時(shí)間并無(wú)益處。

采用Design－expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，獲得斜生柵藻多糖提取的最佳條件為：堿液質(zhì)量濃度0．175mol／L，提取溫度為80．8℃，提取時(shí)間2．1 h，在此條件下，斜生柵藻多糖提取率理論值可達(dá)到10．91%。

圖4 堿液質(zhì)量濃度和提取溫度對(duì)斜生柵藻多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig．4Response surface and contour plot showing the interactive effects of alkali concentration and extraction temperature on the extraction yield of Scenedesmus obliquus polysaccharides

圖5 堿液質(zhì)量濃度和提取時(shí)間對(duì)斜生柵藻多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig．5Response surface and contour plot showing the interactive effects of alkali concentration and extraction time on the extraction yield of Scenedesmus obliquus polysaccharides

圖6 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)斜生柵藻多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig．6Response surface and contour plot showing the interactive effects of extraction temperature and extraction time on the extraction yield of Scenedesmus obliquus polysaccharides

2．2．3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1）根據(jù)擬合的最優(yōu)工藝條件，以堿液質(zhì)量濃度0．175mol／L、提取溫度80．8℃、提取時(shí)間2．1h對(duì)斜生柵藻多糖進(jìn)行提取，提取率達(dá)到11．08%，與模型預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性和可靠性很好。

2）與熱水浸提［8］（90．7℃5．1h）斜生柵藻多糖的提取率（1．93%）相比，堿液浸提優(yōu)化后的多糖提取率提高了4．74倍。堿提和熱水浸提斜生柵藻多糖的單位時(shí)間（h）提取率分別為5．28% 和0．37%，前者是后者的14．27倍，說(shuō)明堿液浸提法同時(shí)提高了斜生柵藻多糖的提取效率。

3 結(jié)論

1）建立了響應(yīng)值與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，并根據(jù)此二次回歸模型，確定了斜生柵藻多糖的堿提最佳工藝參數(shù)為堿液質(zhì)量濃度0．175mol／L，提取溫度80．8℃，提取時(shí)間2．1h。此工藝條件下提取斜生柵藻多糖的提取率達(dá)到11．08%，與模型預(yù)測(cè)值接近，并且建立的數(shù)學(xué)模型（R2＝0．9890）能很好地反映各因素與提取率之間的關(guān)系。

2）優(yōu)化后的堿提斜生柵藻多糖提取率和提取效率較熱水浸提法分別提高了4．74和13．27倍。表明堿液有利于斜生柵藻多糖的提取，也驗(yàn)證了響應(yīng)面法優(yōu)化堿提斜生柵藻多糖工藝是可行的。

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