趙景新，王瑜，何曼，金宇，白倫浩

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是最常見的關(guān)節(jié)炎形式和慢性致殘的首要因素，關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變是OA的基本病變。OA通常分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，而在繼發(fā)性O(shè)A中，由運動引起關(guān)節(jié)軟骨損傷所導(dǎo)致的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎占很大比例。近年來，越來越多的研究表明，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)在OA的發(fā)病機制中起重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組

2月齡清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體重(209±11)g，購自承德醫(yī)學(xué)院實驗動物室。分籠飼養(yǎng)，每籠3只，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼養(yǎng)，自由攝食飲水，動物房溫度18～22℃，相對濕度40%～60%，飼養(yǎng)室每天的明暗時間各為12 h。所有動物實驗前均未進行過跑臺運動實驗，亦未受過任何刺激干擾。

大鼠平衡膳食1周后開始在由跑步機改裝的跑臺上進行適應(yīng)性運動訓(xùn)練3 d，坡度0°，速度10 m/min，時間10 min。適應(yīng)訓(xùn)練后將大鼠隨機分為安靜對照組和高強度運動組，每組12只。休息2 d后進行正式運動。根據(jù)Bedford[1]的研究確定運動強度。正式運動跑臺坡度0°，初始速度10 m/min，在10 min內(nèi)逐漸增加到28 m/min，并維持此速度60 min，每天1次，每周5 d，共6周。高強度運動組大鼠分別于上午8：00～12：00進行跑臺運動，運動中采用聲音、小木棒驅(qū)趕等方式刺激大鼠使其持續(xù)運動。整個運動過程中無電刺激。

1.2 取材與指標(biāo)測定

最后一次運動結(jié)束后24 h，10%水合氯醛0.3 mg/kg腹腔麻醉大鼠。取材前各組大鼠禁食12 h。取各組大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁及滑膜組織，置4%多聚甲醛中固定，股骨內(nèi)側(cè)髁EDTA脫鈣4周，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織結(jié)構(gòu)變化；免疫組化法測定IL-1β在大鼠滑膜中的表達。隨機選取5個視野，在10×40倍鏡下照相，用OlympusBX52 VIEWER顯微圖像采集系統(tǒng)測定陽性單位的積分光密度值(IOD)。

切開大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚及皮下組織，從髕上囊部位向關(guān)節(jié)腔注入生理鹽水0.5 ml，反復(fù)活動關(guān)節(jié)后,抽取灌洗液約0.2 ml。關(guān)節(jié)灌洗液置-70℃保存?zhèn)溆?。大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β水平測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。測定時將每份關(guān)節(jié)腔灌洗液5倍稀釋后,分別取100 μl稀釋液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。免疫組化及ELISA試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色

圖1 安靜對照組關(guān)節(jié)軟骨(HE染色，100×)

安靜對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，表層軟骨細(xì)胞呈梭形，排列密集，其長軸平行于軟骨表面；中間層軟骨細(xì)胞呈圓形，排列無規(guī)律，呈雙細(xì)胞“背靠背”分布；肥大細(xì)胞層細(xì)胞大，由雙細(xì)胞逐漸過渡到多細(xì)胞成團分布，無明顯的潮線；鈣化軟骨層及軟骨下骨無明顯病理改變(圖1)。高強度運動組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)潰瘍?nèi)睋p和小裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)目減少，排列紊亂，有簇聚現(xiàn)象(圖2)。安靜對照組大鼠滑膜組織滑膜細(xì)胞為1～2層，細(xì)胞分布較規(guī)則，滑膜組織無慢性炎癥表現(xiàn)(圖3)。高強度運動組大鼠滑膜組織增生明顯，滑膜細(xì)胞層增生為3～5層，排列紊亂，滑膜下層纖維組織和毛細(xì)血管增生，出現(xiàn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，并可見到滑膜脂肪水腫(圖4)。

2.2 IL-1β

IL-1β在安靜對照組大鼠的滑膜中有少量表達(圖5)。在高強度運動組大鼠滑膜的滑膜細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞呈陽性表達，胞質(zhì)呈棕黃色(圖6)。高強度運動組大鼠滑膜IL-1β的IOD值明顯高于安靜對照組(P＜0.01)。見表1。高強度運動組大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中IL-1β較安靜對照組升高(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠IL-1β比較

圖2 高強度運動組關(guān)節(jié)軟骨(HE染色，100×)

圖5 安靜對照組滑膜(IL-1β免疫組化染色，400×)

3 討論

本研究顯示，6周高強度跑臺運動對關(guān)節(jié)軟骨造成損傷，有導(dǎo)致OA的潛在危險。關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變即創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎，其終末階段與原發(fā)性O(shè)A末期的臨床表現(xiàn)相同。由于外傷或過度訓(xùn)練導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨機械性損傷是OA發(fā)生的常見原因[2]。一些優(yōu)秀運動員，即使他們沒有損傷史，膝關(guān)節(jié)OA發(fā)病風(fēng)險也會增加[3]。運動組大鼠滑膜還出現(xiàn)了滑膜細(xì)胞層次增多，炎細(xì)胞浸潤等滑膜炎表現(xiàn)?；ぱ讜r，滑膜能產(chǎn)生細(xì)胞因子和蛋白水解酶，加速關(guān)節(jié)軟骨的退變[4]。近年來越來越多的研究表明，滑膜組織參與了OA的發(fā)病過程。

圖4 高強度運動組滑膜(HE染色，400×)

圖6 高強度運動組滑膜(IL-1β免疫組化染色，400×)

有關(guān)運動訓(xùn)練對關(guān)節(jié)液及滑膜中IL-1β的研究報道較少。IL-1β在OA的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[5-7]，OA患者關(guān)節(jié)液和滑膜中IL-1β呈現(xiàn)高表達狀態(tài)[8]。IL-1β由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生[9]。IL-1β前體在細(xì)胞內(nèi)合成后，被酶切為成熟形態(tài)后排出到細(xì)胞外。IL-1β通過與軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞表面的受體結(jié)合，刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、IL-6、IL-8和一氧化氮(NO)的合成，同時抑制Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成及軟骨細(xì)胞增殖，對軟骨產(chǎn)生破壞作用[7,10]。尤其在關(guān)節(jié)軟骨已經(jīng)損傷的情況下，關(guān)節(jié)液及滑膜中IL-1β的高表達勢必造成軟骨基質(zhì)得不到有效的修復(fù)，從而使軟骨損傷進一步加重。目前，研究者們已將IL-1β作為OA的治療靶點，通過信號通路調(diào)節(jié)其表達來發(fā)揮治療作用[11-13]。但還處于試驗階段。

長期進行高強度運動，會造成軟骨機械性損傷、滑膜炎癥反應(yīng)和IL-1β在關(guān)節(jié)液與滑膜中的高表達三者之間的惡性循環(huán)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進行性損害，逐漸發(fā)生退變，引起骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。高強度運動所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨損傷、滑膜炎癥以及關(guān)節(jié)液、滑膜中IL-1β的異常表達可能是創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的機制之一。通過合理的治療手段調(diào)節(jié)IL-1β的表達，可能延緩甚至阻斷創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎病情的發(fā)生與發(fā)展。但針對IL-1β的治療目前仍不成熟，需進一步的研究。

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