陳筱云 羅朝暉

1.柳州市紅十字會醫(yī)院藥劑科，廣西柳州 545001；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541004

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk），俗稱山稔子、崗稔、當(dāng)梨等，為桃金娘科植物桃金娘果實。分布于江西、福建、臺灣、廣東、海南、廣西、云南及貴州等省區(qū)。果實成熟完全時極甜，略有澀味，汁液呈誘人的紫紅色，富含多糖、黃酮類、酚類、氨基酸、有機(jī)酸等多種化學(xué)成分，我國民間素有將其泡酒飲用的習(xí)慣，有“養(yǎng)血，止血，澀腸，固精”的功效[1-2]。因此，它具有較高的研究和開發(fā)利用價值。

多糖是由10個以上單糖通過苷鍵連接而成的糖。自然界分布極廣，目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種多糖具有多種生物活性，如具有提高免疫功能，抗衰老，抗腫瘤，抗病毒，抗?jié)?，降血糖，降血脂，抗氧化，抗自由基和增加各類?xì)胞因子表達(dá)的作用[3]。本文采用水提醇沉法提取桃金娘多糖，用苯酚-硫酸法測定其含量，為開發(fā)利用桃金娘資源提供理論依據(jù)。

1 主要儀器、試劑及材料

BT224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；紫外分光光度計（日本島津UV-2550）；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀及201-恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；電熱套；離心機(jī)；干燥箱；循環(huán)水式真空泵。

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、苯酚，濃硫酸、石油醚（60～90℃）、95%乙醇、氯仿、正丁醇、無水乙醇、乙醚、丙酮均為分析純。

桃金娘果實采于桂林市永?？h（9～10月份），藥材經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院生藥教研室杜澤鄉(xiāng)副教授鑒定，為桃金娘科植物桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk）果實，冷藏保鮮。

2 實驗方法

2.1 桃金娘多糖提取工藝

稱取新鮮桃金娘果實500 g，用剪刀稍剪開后置2000 mL圓底燒瓶中，加石油醚900 mL，80℃水浴回流提取1.5 h，重復(fù)提取1次（600 mL，1 h），濾出溶劑，濾渣揮干溶劑后加80%乙醇1000 mL，浸泡過夜（約13 h）后90℃水浴回流提取1 h，重復(fù)提取1次（500 mL，1 h），濾過，濾渣揮干溶劑后加600 mL蒸餾水95℃水浴回流提取1 h，再重復(fù)提取3次，合并4次提取液，減壓濃縮至200 mL，以每100 mL濃縮液加20 mL氯仿-正丁醇（4：1）液，置分液漏斗中振搖20 min，離心15 min，去除下層氯仿及中層變性蛋白，取上部水層再重復(fù)操作至無明顯中層為止。上清液加3倍量95%乙醇沉淀多糖，4℃冰箱放置45 h，抽濾，沉淀依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌4次（20 mL/次），得桃金娘多糖，置60℃烘箱干燥至恒重得2.78 g，放入干燥器中保存?zhèn)溆肹4]。

2.2 苯酚溶液的配制

加熱苯酚使其溶解，趁熱取100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g置150 mL圓底燒瓶中，電熱套加熱（182℃）蒸餾收集餾分至棕色瓶中備用，趁熱從中精密稱取5 g置100 mL棕色容量瓶中，加水定容至刻度，即得5%苯酚溶液（臨用前新配）[5]。

圖1 最大吸收波長掃描圖

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1014 g置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻后從中精密吸取10.0 mL置100 mL容量瓶定容至刻度，即得0.1014 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

2.4 最大吸收波長的選擇

精密吸取0.1014 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液1.0 mL，置10 mL具塞試管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，混勻，陰暗處放置10 min后置沸水浴中加熱15 min，取出立即冷卻后陰暗處放置20 min。以蒸餾水同法操作為空白對照，于400～550 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在487 nm處有最大吸收（如圖1），因此選擇測定波長為487 nm。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取0.1014 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9 mL分別置10 mL具塞試管中，再分別加蒸餾水至1.0 mL，然后分別加5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，再迅速加濃硫酸5.0 mL，混勻，陰暗處放置10 min后置沸水浴中加熱15 min，取出后立即冷卻，陰暗處放置20 min，以蒸餾水1.0 mL同法操作為空白對照，照紫外分光光度法在487 nm處測定吸光度A，以葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，做回歸處理，得回歸方程為A=0.07376C+0.0036，相關(guān)系數(shù)r2=0.99967，葡萄糖在1.449～13.037 μg/mL范圍內(nèi)與A呈良好的線性關(guān)系[6]。

2.6 換算因子的測定

精密稱取干燥至恒重的桃金娘多糖21.67 mg置100 mL容量瓶中，加溫?zé)岬恼麴s水溶解并稀釋至刻度，從中精密吸取1.0 mL，3份分別置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作項下方法自“加5%苯酚溶液1.0 mL起，依法測定吸光度，求平均吸光度、RSD。由回歸方程求出該多糖液中葡萄糖的濃度C，按下式計算換算因子。換算因子f=W/CD（式1）[7]。

式中W為稱取多糖的重量μg；C為該多糖液中葡萄糖的濃度μg/mL；D為多糖的稀釋倍數(shù)。

2.7 樣品中桃金娘多糖的含量測定[7]

2.7.1 樣品溶液的制備 取桃金娘鮮果一個精密稱取得1.8480 g，置150 mL圓底燒瓶中，用玻棒稍壓破后加80%乙醇50 mL，90℃水浴攪拌回流提取1 h，趁熱抽濾，濾渣用80%乙醇洗滌兩次，揮干溶劑后加熱水60 mL于95℃水浴攪拌回流提取2 h，抽濾，濾渣用熱水多次洗滌，濾液用容量瓶定容至200 mL，即得樣品溶液。

2.7.2 樣品溶液中多糖的含量測定 精密吸取樣品溶液1.0 mL（3份），置10 mL具塞試管中，照2.5方法測定吸光度A，由回歸方程計算樣品溶液中葡萄糖的濃度C，按照下式計算含量。

多糖含量（%）=CDf/W×100%（式2）

式中D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，W為樣品的取樣量（μg），f為換算因子，C為樣品溶液中葡萄糖的濃度（μg/mL）。

2.8 方法學(xué)考察

2.8.1 穩(wěn)定性試驗 精密吸取樣品溶液1.0 mL，置10 mL具塞試管中，照2.5方法測定吸光度A，每隔30 min測定一次，共測4次（2 h內(nèi)），考察生成物顏色的穩(wěn)定性。

2.8.2 重現(xiàn)性試驗 取桃金娘鮮果3個，分別精密稱取得1.8480、1.7869、1.7351 g，照2.7.1項下制備得溶液a、b、c，每份精密吸取1.0 mL各3份共9份，分別置10 mL具塞試管中，再照2.5方法測定吸光A，計算多糖的含量并求平均值。

2.8.3 加樣回收率試驗 精密吸取樣品溶液5.0 mL，3份分別置10 mL容量瓶中，再按高、中、低三個濃度分別加0.1014 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液2.7、3.4、4.1 mL，加水定容至10 mL，即得加樣液①、②、③，從中各取1.0ml3份共9份分別置10 mL具塞試管中，照2.5方法測定吸光度A，計算加樣回收率。

3 實驗結(jié)果與結(jié)論

3.1 實驗結(jié)果

3.1.1 換算因子 測得的數(shù)據(jù)A1=0.756，A2=0.739，A3=0.733，平均吸光度A=0.743，RSD=1.61%＜2%，將A代入回歸方程A=0.07376C+0.0036得C=10.024μg/mL

由式1計算換算因子f=W/CD=21.67×103/10.024×700=3.088

3.1.2 多糖含量及重現(xiàn)性 由回歸方程求出樣品液中葡萄糖的濃度C（μg/mL），由式2計算多糖平均含量為2022%，RSD=4.13%，可見重現(xiàn)性較好，方法可行。

3.1.3 穩(wěn)定性 苯酚-硫酸顯色后，樣品溶液在2 h內(nèi)吸光度在0.725～0.733之間，基本穩(wěn)定。

表1 加樣回收率結(jié)果

3.1.4 加樣回收率 測得數(shù)據(jù)及計算結(jié)果見表1，證明了該含量測定的方法可靠。

3.2 實驗結(jié)論

本實驗通過水提醇沉法從桃金娘鮮果中提取了多糖，得到淺棕色片狀桃金娘多糖，苯酚-硫酸顯色呈棕紅色。用苯酚-硫酸比色法測定桃金娘鮮果中多糖的含量，最大吸收波長為487 nm，顯色條件為1.0 mL，5%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸、反應(yīng)時間15 min，濃度在1.449～13.037 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，測得多糖含量為2.22%?？梢姡迷摲椒y定桃金娘果實中多糖的含量是可行的，其方法穩(wěn)定可靠，簡單易行，為研究桃金娘果實中的多糖成分提供實驗依據(jù)。對于其他提取與含量測定的方法及該多糖組分的鑒定還有待進(jìn)一步研究。

[1] 趙新先.原色中草藥圖集[M].廣州：世界圖書出版社，2003：20-21.

[2] 秦小明，隋亞君，寧恩創(chuàng).桃金娘果實多糖的構(gòu)造研究[J].食品科學(xué)，2005，26（4）：79.

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