楊文龍，陳雅蘅，王繼金，劉 勇，周幗萍*

（武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，簡(jiǎn)稱Bc）是一種廣泛存在于空氣、土壤中的條件致病菌，也是最常見的食源性致病菌之一，4℃～50℃皆能生長(zhǎng)，能引起嘔吐型和腹瀉型2種不同類型的食物中毒。嘔吐型食物中毒是高度穩(wěn)定的嘔吐毒素（Cereulide）引起中毒，嚴(yán)重時(shí)能致死，多為儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)奶妓衔锸称芬?。腹瀉型食物中毒與多種腸毒素（如溶血素Hbl、非溶血性的腸毒素Nhe和細(xì)胞毒素CytK等）有關(guān)，中毒癥狀相對(duì)溫和，多為儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)食品引起。中毒主要癥狀是惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、頭暈等，中毒的食物中檢出Bc數(shù)量一般在105CFU/g～108CFU/g。Bc能在多種食物中檢測(cè)出，如剩米飯、米粉、面粉等淀粉食物，甜點(diǎn)、肉類制品等富含脂類及蛋白質(zhì)的食品[1]。

從國內(nèi)外Bc食物中毒死亡案例來看，國外案例幾乎都與未成年人相關(guān)，國內(nèi)大多數(shù)案例也涉及到未成年人[2]。在1995年我國湖南省有一個(gè)案例報(bào)道有多名兒童在食用某多維米粉及全脂營養(yǎng)奶粉后出現(xiàn)嘔吐、發(fā)熱、腹瀉等癥狀，其中4名兒童因高熱抽搐死亡[3]，這是我國蠟樣芽孢桿菌食物中毒案例中最嚴(yán)重的案例之一。說明嬰幼兒因免疫力低下，對(duì)該類細(xì)菌中毒更敏感。

Bc的鑒定目前有很大爭(zhēng)議。蠟樣芽孢桿菌群細(xì)菌（B.cereus）原來包括了蠟樣芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）、蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）、蕈狀芽孢桿菌（B.mycoides）和假蕈狀芽孢桿菌（B.pseudomycoides）、韋氏芽孢桿菌（B.weihenstephanensis）6個(gè)種，2010-2013年又增加了3個(gè)新種：B.cytotoxicus[4]、B.manliponensis[5]和B.gaemokensis[6]。由于該群內(nèi)各種間在基因組上的高度一致，必須采用非常復(fù)雜的生理生化反應(yīng)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)才能鑒定，加上一些新種的定義還存在很大爭(zhēng)議，要準(zhǔn)確鑒定蠟樣芽孢桿菌幾乎成為不可能完成的任務(wù)；現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.14—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》和食品及藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）標(biāo)準(zhǔn)都未與最新分類系統(tǒng)接軌，同時(shí)很多研究者也質(zhì)疑標(biāo)準(zhǔn)中所采用生理生化法的繁瑣和準(zhǔn)確性[7]；同時(shí)因?yàn)锽c有很多毒素基因，除嘔吐毒素合成相關(guān)基因外，都位于基因組內(nèi)，并廣泛分布在Bc群各種菌株中，所以很多學(xué)者在探討食品安全問題時(shí)也將Bc群細(xì)菌一起討論[8-9]。本研究鑒定的Bc，嚴(yán)格意義上僅鑒定到Bc群，排除了蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和假蕈狀芽孢桿菌，但是未區(qū)分其他6個(gè)種。

本研究從細(xì)菌總數(shù)和食源性致病菌——蠟樣芽孢桿菌2個(gè)指標(biāo)分析嬰幼兒輔食的微生物污染情況，以期提高嬰幼兒食品的質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 檢測(cè)樣品

市售嬰幼兒輔食，覆蓋高中低檔產(chǎn)品及國內(nèi)外32個(gè)品牌，樣品均購自超市保質(zhì)期內(nèi)合格產(chǎn)品，共101份（米粉60份；奶伴侶30份；面條11份）。

1.1.2 培養(yǎng)基

胰酪胨大豆多粘菌素肉湯（trypticsoypolymyxinbroth，TSPB）培養(yǎng)基：胰酪胨17.0g，植物胨3.0g，氯化鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，蒸餾水稀釋至1000mL，pH7.3±0.1；甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂（mannitol yolk polymyxin agar，MYP）培養(yǎng)基：a.牛肉膏1.0g，蛋白胨10g，D-甘露醇10.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂15g，酚紅0.025g（配成溶液加入），蒸餾水稀釋至900mL，pH 7.2±0.1，b.50%卵黃液，c.多粘菌素B 100IU/mL，將a液121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃后加入b液和10mL c液；Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母提取物5g，瓊脂20g，蒸餾水稀釋至1000mL；平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15g，蒸餾水稀釋至1000mL，pH7.2±0.2。

1.2 儀器與設(shè)備

GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YS100正置熒光相差顯微鏡：日本Nikon公司；TC-312 PCR儀：英國TECHNE公司；680X SYNGENE凝膠圖像分析系統(tǒng)：英國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數(shù)測(cè)定

根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.12—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[10]。

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)

按照進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0176—1992《出口食品中蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)方法》[11]，采用最大近似值（most probable number，MPN）法檢測(cè)。

1.3.3 ITS PCR檢測(cè)

PCR擴(kuò)增體系：2×TaqPCR Mix 25μL；上下游引物各1μL；DNA模板5μL；加水至50μL。16S～23SrDNA間隔區(qū)引物：ITS-16S-1392-S-15（GNACACACCGCCCGT）；ITS-23S-206-A-21（NCTTAGATGTTTCAGTTCVCY），擴(kuò)增條件：95℃、1min；95℃、45s；55℃、1min；72℃、1min30s；循環(huán)30次；后延伸72℃、5min[12-13]。

1.3.4 形態(tài)觀察

染色后用顯微鏡觀察有無伴孢晶體排除蘇云金芽孢桿菌；在PCA和LB平板上是否根狀生長(zhǎng)，排除蕈狀和假蕈狀芽孢桿菌。再確定蠟樣芽孢桿菌的管數(shù)，由MPN表計(jì)算蠟樣芽孢桿菌的MPN值。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌的鑒定

圖1 部分Bacillus cereus16S/23S rDNA ITS PCR結(jié)果Fig.1 Partial result of PCR analysis of 16S/23S rDNA ITS of Bacillus cereus

由圖1可知，炭疽芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌等芽孢桿菌群細(xì)菌在進(jìn)行16S～23S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的PCR分析時(shí)呈現(xiàn)一致的特征條帶，可以與近緣其他芽孢桿菌區(qū)分，成為該群細(xì)菌分型和鑒定有力的工具[12-13]。選取在MYP培養(yǎng)基中呈現(xiàn)典型蠟樣芽孢桿菌群細(xì)菌菌落特征的菌株進(jìn)行ITS序列分析。第二道的枯草芽孢桿菌出現(xiàn)了3條亮帶（約為500bp、700bp和900bp），而其他菌株包括Bc標(biāo)準(zhǔn)株均會(huì)出現(xiàn)2條亮帶（500bp和750bp），驗(yàn)證了文獻(xiàn)方法，說明ITS序列分析在鑒別Bc群微生物有效性。通過ITS PCR分析可以將分離株鑒定到Bc群細(xì)菌。

圖2 Bacillus cereus鏡檢結(jié)果Fig.2 Microscopic examination result ofBacillus cereus

鏡檢觀察分離株菌體為桿狀，成短或長(zhǎng)鏈。產(chǎn)芽胞，芽胞圓形或柱形，中生或近中生，孢囊與菌體等寬，未發(fā)現(xiàn)伴孢晶體，排除蘇云金芽孢桿菌，圖2為Bc典型株的顯微形態(tài)。PCA平板上37℃，培養(yǎng)24h可形成灰白色，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，較大菌落，未發(fā)現(xiàn)有根狀生長(zhǎng)的特征，排除蕈狀和假蕈狀芽孢桿菌。

2.2 嬰幼兒輔食中菌落總數(shù)及蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)

GB10769—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒谷類輔助食品》中菌落總數(shù)的規(guī)定[14]，菌落總數(shù)不得超過104CFU/g（mL）。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，101份樣品中僅30個(gè)樣品的菌落總數(shù)達(dá)標(biāo)，達(dá)標(biāo)率僅為29.7%，菌落總數(shù)的幾何平均數(shù)為1.9×104CFU/g。蠟樣芽孢桿菌的陽性檢出率為96.9%（95/98），陽性樣品含菌量在3CFU/g～1100CFU/g范圍內(nèi)，19個(gè)樣品的Bc菌數(shù)大于1100CFU/g，幾何均數(shù)為350.7CFU/g。

2.3 不同品牌嬰幼兒輔食中細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)

對(duì)32個(gè)品牌產(chǎn)品中細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌含菌量進(jìn)行比較，有18個(gè)地方性小品牌因生產(chǎn)品種單一，采樣數(shù)量有限，將其合并列入地方品牌進(jìn)行對(duì)比。

圖3 不同品牌嬰幼兒輔食中細(xì)菌總數(shù)檢出結(jié)果Fig.3 Examination results of total bacterial count in infant formula food of different brand

圖4 不同品牌嬰幼兒輔食中蠟樣芽孢桿菌的檢出結(jié)果Fig.4 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food of different brands

經(jīng)分析各個(gè)品牌嬰幼兒輔食中的細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌檢出情況有顯著性差異（p＜0.05），如伊利、方廣和雅士利等品牌的細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌含菌量都較低；而酷幼、百氏利臣和小阿哥等品牌產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌含菌量都偏高。各品牌之間的差異反應(yīng)了不同的生產(chǎn)商采取的滅菌工藝的不同和過程監(jiān)控水平的差異。但也須指出，即使是同一品牌的不同批次樣品，其檢出情況也有較大波動(dòng)，說明每個(gè)品牌在生產(chǎn)不同批次的產(chǎn)品時(shí)可能因?yàn)樵o料、設(shè)備和溫濕度等環(huán)境因素造成微生物污染水平的波動(dòng)。從這次檢測(cè)分析數(shù)據(jù)來看，Bc并非嬰幼兒輔食中的優(yōu)勢(shì)菌，其數(shù)量占細(xì)菌總數(shù)的0～7%。

2.4 不同類別嬰幼兒輔食中細(xì)菌總數(shù)及蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)

圖5 不同類別嬰幼兒輔食中細(xì)菌總數(shù)的檢出結(jié)果Fig.5 Examination results of total bacterial count in infant formula food of different classes

圖6 不同類別嬰幼兒輔食中蠟樣芽孢桿菌的檢出結(jié)果Fig.6 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food of different classes

由圖5和圖6可知，比較配方米粉、奶伴侶和面條3類產(chǎn)品中細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌數(shù)的檢出結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在3種水分活度很低的干粉（或干條快）狀食品中這2項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)出配方米粉＞奶伴侶＞面條的趨勢(shì)。

2.5 不同添加配料嬰幼兒輔食中Bc檢測(cè)

市售嬰兒配方米粉配料中維生素和礦物質(zhì)大多類似，常添加的一些配料來改變口味，不同品牌間同一口味的配料有少許差異，但主要配料類似。根據(jù)配方中的配料進(jìn)行分類比較，不同添加配料Bc檢測(cè)情況見表1。

表1 不同配料嬰幼兒輔食中蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)結(jié)果Table 1 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food with different ingredients

由表1可知，無添加口味即原味嬰幼兒輔食蠟樣芽孢桿菌的含菌量為最低，其他有添加配料的樣品Bc都比無添加的高。添加有雙歧桿菌等益生菌的樣品細(xì)菌總數(shù)最低可能是因?yàn)椴捎玫氖呛醚蹙?xì)菌總數(shù)測(cè)定的方法，厭氧菌不長(zhǎng)，檢不出來；同時(shí)可能存在拮抗效應(yīng)導(dǎo)致好氧菌數(shù)量下降；但是其復(fù)雜的發(fā)酵、調(diào)配工序增加了Bc污染幾率導(dǎo)致Bc均數(shù)偏高，也反應(yīng)出益生菌的發(fā)酵對(duì)蠟樣芽孢桿菌沒有明顯的拮抗/抑制作用。一般認(rèn)為Bc作為土壤中常見細(xì)菌容易污染植物性原料，這些植物配料的加入會(huì)導(dǎo)致染菌風(fēng)險(xiǎn)上升。但是研究發(fā)現(xiàn)添加肉蛋類配方也會(huì)導(dǎo)致Bc含菌量的升高，達(dá)到甚至高于添加蔬菜和谷物等植物性輔料產(chǎn)品。

2.6 不同貨架期嬰幼兒輔食中細(xì)菌總數(shù)及蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)

圖7 不同貨架期嬰幼兒輔食中細(xì)菌總數(shù)檢出結(jié)果Fig.7 Examination results of total bacterial count in infant formula food of different shelf-life

圖8 不同貨架期嬰幼兒輔食中蠟樣芽孢桿菌的檢出結(jié)果Fig.8 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food of different shelf-life

所有產(chǎn)品的保質(zhì)期在14～18個(gè)月，由圖7、圖8可知，在貨架期在5個(gè)月之前，細(xì)菌總數(shù)基本穩(wěn)定有緩慢增加趨勢(shì)，蠟樣芽孢桿菌數(shù)基本穩(wěn)定；但到第5個(gè)月之后，細(xì)菌總數(shù)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是蠟樣芽孢桿菌數(shù)卻顯著增加。這可能是由于包裝好的嬰兒輔食中水分活度較低，細(xì)菌總數(shù)穩(wěn)定，長(zhǎng)期甚至可能緩慢下降，可能由于無競(jìng)爭(zhēng)微生物，食源性致病菌蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量卻在貨架期5個(gè)月后開始大幅度上升。說明如果在產(chǎn)品貨架期內(nèi)僅用細(xì)菌總數(shù)來衡量微生物的污染和增殖情況，并推測(cè)產(chǎn)品的安全，不僅片面而且有風(fēng)險(xiǎn)。以上幾何均數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。

3 討論

嬰幼兒免疫力低、食物品種單一，食物中毒風(fēng)險(xiǎn)高，所以嬰幼兒食品的各項(xiàng)安全指標(biāo)要高于普通成人食品。此次調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)單就細(xì)菌總數(shù)而言：101份樣品居然只有30份樣品菌落總數(shù)達(dá)標(biāo)，合格率僅為29.7%；而且部分超標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)居然達(dá)到105CFU/g～106CFU/g。另外，從食源型致病菌蠟樣芽孢桿菌的檢出情況也不容樂觀：樣品中Bc檢出率達(dá)96.9%，平均含菌量為350.7CFU/g，19個(gè)（19.4%）樣品的蠟樣芽胞桿菌超過1100CFU/g。雖然我國對(duì)于嬰幼兒食品中Bc的含量還沒有制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，但就國際上來說，澳大利亞規(guī)定嬰幼兒乳粉Bc含菌量＜103CFU/g；新西蘭對(duì)嬰兒食用乳粉要求高，Bc含菌量＜102CFU/g；挪威、愛爾蘭、加拿大（嬰幼兒食品）等限定食品中Bc含菌量＜104CFU/g。

Bc的污染可能來源于原料，還有生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)備。嬰兒輔食主要由大米和奶粉作為主要原料，而這兩種恰恰是Bc污染比較嚴(yán)重的食品原料。在Bc食物中毒中有70%的案例都是由米飯引起[15]。本實(shí)驗(yàn)室調(diào)查我國市售大米中Bc的污染情況發(fā)現(xiàn)80%的大米受到Bc污染，原料奶中最常見的污染菌就是Bc群細(xì)菌，噴霧干燥不能完全滅活芽孢，奶粉在包裝等后續(xù)工藝中也可能受到后污染，這些芽孢在貯藏、銷售和消費(fèi)的過程中，一旦條件合適就能生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)毒[16]。最為危險(xiǎn)的是熱穩(wěn)定毒素Cereulide，一旦合成，后續(xù)的任何食品加工工序都無法使其失活[1]。

另一方面食品加工工序越是復(fù)雜，越容易受到微生物污染。配料越多、工藝越復(fù)雜，往往Bc含菌量越高。研究顯示在Bc可以吸附到不銹鋼材料等設(shè)備表面，在生產(chǎn)過程中污染產(chǎn)品[17]。特別是Bc能產(chǎn)芽胞、具有耐熱性，一般食品加工的熱處理和消毒殺菌條件不一定能完全殺滅芽胞。如果企業(yè)重視衛(wèi)生管理和質(zhì)量監(jiān)控，加強(qiáng)工藝的優(yōu)化，保證設(shè)備定期清潔，加工過程中將被污染可以大大降低。

作為條件致病菌的蠟樣芽孢桿菌是否會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重食物中毒取決于3個(gè)因素：含菌量；菌株致病力；食用前的加工和保存條件，所以即使是達(dá)標(biāo)產(chǎn)品保存不當(dāng)也存在一定風(fēng)險(xiǎn)。歐洲食品安全局就特別指出：嬰兒配方食品如檢出致病性的Bc，經(jīng)溫水調(diào)和后如果存放不當(dāng)可能導(dǎo)致其繁殖并產(chǎn)毒。沖調(diào)類嬰兒食品應(yīng)一次食完，未食用完的已沖調(diào)好的嬰兒配方米粉不可放入冰箱冷藏再食用，防止嘔吐毒素Cereulide在室溫和冷藏時(shí)合成，如再次食用，即使原含菌量很低的產(chǎn)品也可能因細(xì)菌增殖和產(chǎn)毒使抵抗力低的嬰幼兒中毒[17]。

4 結(jié)論

市售嬰兒輔食中細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌污染檢測(cè)分析結(jié)果表明，101份樣品中只有30份樣品菌落總數(shù)達(dá)標(biāo)，合格率僅為29.7%，部分超標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)達(dá)105CFU/g～106CFU/g；其中食源型致病菌蠟樣芽孢桿菌的檢出率為96.9%，陽性樣品含菌量在3CFU/g～1100CFU/g范圍內(nèi)，平均含菌量為350.7CFU/g，19個(gè)樣品的蠟樣芽孢桿菌超過1100CFU/g。

我國對(duì)于嬰幼兒食品中Bc的含量應(yīng)盡快制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，提升嬰幼兒配方食品的質(zhì)量安全水平，保障嬰幼兒食用安全、放心的食品，這關(guān)系下一代健康成長(zhǎng)，關(guān)系億萬家庭的幸福和國家民族的未來。

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