段亞飛，劉 萍，李吉濤，李 健，高保全，陳 萍

1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；

2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306

脊尾白蝦 (Exopalaemon carinicauda)，是中國(guó)黃、渤海重要的底棲蝦類 (Liu，1955)。因其繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快及環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，養(yǎng)殖面積得到迅速擴(kuò)大，成為我國(guó)近海重要的經(jīng)濟(jì)蝦類。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大及生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，蝦類疾病頻繁發(fā)生，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Li et al，2012a；Xu et al，2010)。脊尾白蝦具有先天免疫防御功能，且其防御功能的發(fā)揮與免疫基因有關(guān)，因此發(fā)掘脊尾白蝦免疫基因并加強(qiáng)免疫機(jī)制研究顯得尤為重要。

組織蛋白酶L(cathepsin L，CatL)是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成員，廣泛存在于各種生物有機(jī)體中(Liu et al，2006；Zeng et al，2005)。它不僅參與生物體內(nèi)的各種蛋白水解，還參與抗原呈遞、組織再生、腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)吸收及細(xì)胞凋亡等重要生命活動(dòng)(Dohchin et al，2000；Furuyama & Fujisawa，2000；Kos et al，2000；Lindeman et al，2004)。目前已見(jiàn)水產(chǎn)動(dòng)物的組織蛋白酶L基因相關(guān)報(bào)道。組織蛋白酶L在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)(Zhao et al，2007)、中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)(Bu et al，2008)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)(Li et al，2010)及紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)(Venier et al，2006)等水產(chǎn)動(dòng)物免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用，但其在脊尾白蝦中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為深入了解組織蛋白酶L在脊尾白蝦中的免疫作用，本研究利用從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的脊尾白蝦血細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中篩選得到的組織蛋白酶L基因EST序列，采用RACE技術(shù)，克隆得到該基因全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其在鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)感染后的脊尾白蝦組織中的表達(dá)特征進(jìn)行了初步研究，以期為脊尾白蝦組織蛋白酶L生物學(xué)功能研究及其對(duì)病原的抗病機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康脊尾白蝦取自青島膠州，體長(zhǎng)(5.81±0.32)cm，體重(1.18±0.35) g。暫養(yǎng)于200 L的PVC桶中，每桶30尾，暫養(yǎng)一周。養(yǎng)殖水溫24 ℃，鹽度25，pH 8.2，持續(xù)充氧，每天換水1/3，投喂配合飼料。

TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；SMARTTMRACE Amplification Kit和 Advantage 2 PCR Kit購(gòu)自Clontech公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工公司；PMD18-T載體和大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自 TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

Trizol試劑提取血細(xì)胞總RNA，按照Invitrogen說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；紫外分光光度計(jì)與1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量及完整性。

1.3 全長(zhǎng)cDNA的克隆及測(cè)序

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的脊尾白蝦血細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，通過(guò)隨機(jī)測(cè)序獲得組織蛋白酶L基因的 EST序列，利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)3'RACE和 5'RACE特異性引物，所有引物均由上海生工合成。

3'和 5'末端擴(kuò)增使用 SMARTTMRACE Amplification Kit和 Advantage 2 PCR Kit進(jìn)行。3'RACE使用引物CatL-F1 (表1)和通用引物UPM配對(duì)，進(jìn)行3'端擴(kuò)增；5'RACE使用引物CatL-R1 (表1)和通用引物 UPM，進(jìn)行 5'端擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Sequence of study primers

3'和5'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒回收目的片段，與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落 PCR鑒定后，送往上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列分析

利用DNAStar軟件中的SeqMan程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行載體序列去除和序列拼接，然后用 EditSeq程序進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(ORF)的預(yù)測(cè)和氨基酸翻譯。EcCatL基因的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列使用BLAST(http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對(duì)。利用 Protparam 軟件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)。利用 Interpro Scan軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tool/InterProScan)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析。使用Clustal X軟件對(duì)脊尾白蝦與其他物種的 CatL氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，在此基礎(chǔ)上采用 MEGA 4.0軟件，以鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 鰻弧菌和WSSV感染實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用 WSSV粗提液為黃海水產(chǎn)研究所病研室所贈(zèng)，方法見(jiàn)Li et al (2012b)。實(shí)驗(yàn)用鰻弧菌為黃海水產(chǎn)研究所楊愛(ài)國(guó)實(shí)驗(yàn)室所贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)用鰻弧菌于實(shí)驗(yàn)前一天進(jìn)行菌種活化，經(jīng)2611E液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后離心取沉淀，用無(wú)菌生理鹽水稀釋為2×108pfu/mL的菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)挑取 10尾脊尾白蝦，經(jīng)白斑病毒綜合征檢測(cè)試劑盒檢測(cè)證實(shí)無(wú)WSSV感染。隨機(jī)選取暫養(yǎng)7 d的健康脊尾白蝦分為對(duì)照組、鰻弧菌感染組和WSSV感染組，每組50尾。鰻弧菌感染組在每尾蝦第二腹節(jié)部位注射鰻弧菌菌懸液20 μL，WSSV感染組在每尾蝦第二腹節(jié)部位注射WSSV粗提液20 μL，對(duì)照組注射等體積生理鹽水。各組分別于注射后0、3、6、12、24、48及72 h取血細(xì)胞和肝胰腺，用于RNA提取，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6尾。此外，為檢測(cè)脊尾白蝦 EcCatL基因在不同組織中的表達(dá)水平，另取6尾健康脊尾白蝦的血細(xì)胞、鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢、腸、胃和眼柄組織，用于RNA提取。

1.6 EcCatL基因表達(dá)分析

TRIzol試劑提取不同實(shí)驗(yàn)組脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，方法按Han et al (2011)進(jìn)行。

根據(jù)已獲得的脊尾白蝦內(nèi)參基因18S rRNA和EcCatL基因全長(zhǎng)序列，分別設(shè)計(jì)一對(duì)正反引物(18S rRNA-F/R及CatL-F2/R2)(表1)，利用Real-time PCR對(duì)不同時(shí)間鰻弧菌和 WSSV感染的脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中EcCatL基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系為 20 μL，包括 10 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (×2)，0.8 μL 10 μmol/L 引物 CatL-F2，0.8 μL 10μmol/L 引物 CatL-R2，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ (×50)*3，2.0 μL cDNA，6.0 μL DEPC 水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用2-△△CT法計(jì)算EcCatL基因的表達(dá)量，用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 EcCatL基因全長(zhǎng)cDNA克隆

利用 Trizol試劑提取獲得脊尾白蝦血細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，其 OD260/OD280為1.91，表明總RNA純度較高；經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，18S和28S rRNA條帶清晰，完整性較好，符合實(shí)驗(yàn)要求。以特異性引物CatL-F1和CatL-R1分別與通用引物UPM配對(duì)，進(jìn)行3'RACE和5'RACE擴(kuò)增，獲得～441和～500 bp的特異性條帶各一 (圖1)。

圖1 總RNA 和3'RACE、5'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析Figure 1 Analysis of total RNA and amplification products of 3', 5'RACE by 1.0% agarose gel electrophoresis

2.2 EcCatL基因全長(zhǎng)cDNA序列特征分析

3'RACE和 5'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物分別測(cè)序后與EST序列進(jìn)行拼接，獲得脊尾白蝦CatL基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為EcCatL，GenBank登錄號(hào)為JX508645。該基因全長(zhǎng)1 136 bp，包括24 bp的5'端非編碼區(qū)(UTR)，152 bp的3'端非編碼區(qū)和960 bp的開(kāi)放閱讀框。3'端含有多聚腺苷酸加尾信號(hào)AATAAA和PolyA尾 (圖2)。

圖2 脊尾白蝦EcCatL基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of E. carinicauda EcCatL gene

氨基酸序列分析可知，EcCatL基因編碼一個(gè)由319個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)域分析表明，其N端含有15個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，成熟肽位于第15～319位氨基酸之間，分子量為35.30×103，理論等電點(diǎn)為5.27。結(jié)構(gòu)域分析表明，EcCatL屬于典型的組織蛋白酶中的半胱氨酸蛋白酶家族，第123～134位氨基酸殘基、第264～274位氨基酸殘基及第 281～300位氨基酸殘基分別為半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸、組氨酸及天冬氨酸活性位點(diǎn)。該蛋白存在組織蛋白酶 L所特有的保守基序 ERFNIN[E-X3-R-X2-(I/V)-F-X3-N-X3-I-X3-N]和 GCXGG。

2.3 EcCatL基因同源性分析

利用BLAST對(duì)脊尾白蝦EcCatL基因進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦 EcCatL基因與變色小長(zhǎng)臂蝦(Palaemonetes varians)和北極甜蝦(Pandalus borealis)的同源性最高，分別為92%和76%。與其它蝦蟹類如挪威海螯蝦(Nephrops norvegicus)、美洲螯龍蝦(Homarus americanus)、刀額新對(duì)蝦(Metapenaeus ensis)、凡納濱對(duì)蝦、中華絨螯蟹及阿拉斯加帝王蟹(Paralithodes camtschaticus)等的同源性分別為 57%、56%、53%、53%、51%和 48%；與其它無(wú)脊椎動(dòng)物動(dòng)物如赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)和紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus)的同源性分別為 53%、52%、50%、51%和 50%；與脊椎動(dòng)物非洲象(Loxodonta africana)的同源性為48%。利用MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，脊尾白蝦組織蛋白酶 L EcCatL與變色小長(zhǎng)臂蝦緊密聚為一支，之后聚類順序依次為北極甜蝦、挪威海螯蝦及美洲螯龍蝦等 (圖3)。

圖3 利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建的基于CatL氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 3 NJ phylogenetic tree based on CatL amino acid sequences by MEGA 4.0

通過(guò)與北極甜蝦、凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦及中華絨螯蟹等甲殼動(dòng)物的組織蛋白酶L的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸、組氨酸及天冬氨酸活性位點(diǎn)都高度保守，保守基序ERFNIN、GNFD和GCXGG在8種甲殼動(dòng)物中都存在。

2.4 EcCatL基因組織表達(dá)分析

利用Real-time PCR分析了脊尾白蝦EcCatL基因在不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明：EcCatL基因在血細(xì)胞、鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢、腸、胃及眼柄中都有表達(dá)。其中，在肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次為血細(xì)胞、鰓、胃、卵巢及肌肉，在腸和眼柄中的表達(dá)量最少(圖5)。

圖4 脊尾白蝦EcCatL氨基酸序列與其他物種CatL氨基酸序列比對(duì)Figure 4 Amino acid sequences alignment of E. carinicauda EcCatL with other species’ CatL

圖5 脊尾白蝦組織蛋白酶L EcCatL基因在不同組織中的表達(dá)分布Figure 5 Distribution of EcCatL gene expression in different tissues of E. carinicauda

Real-time PCR檢測(cè)脊尾白蝦在注射鰻弧菌和WSSV后不同時(shí)間血細(xì)胞中EcCatL基因的表達(dá)情況(圖6)。結(jié)果表明：鰻弧菌和WSSV刺激后，血細(xì)胞中 EcCatL基因的表達(dá)量都極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。其中，鰻弧菌感染組和WSSV感染組血細(xì)胞中EcCatL基因表達(dá)量在注射早期(0～3 h)均出現(xiàn)下降，6～12 h開(kāi)始不斷上升，于12 h達(dá)到最高值；在24～48 h表達(dá)量開(kāi)始下降，并于48 h極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；72 h后表達(dá)量逐漸上升至初始水平。血細(xì)胞中 EcCatL基因的表達(dá)量總體表現(xiàn)為下降、升高、再下降、再升高至初始水平的趨勢(shì)。

圖6 注射鰻弧菌和WSSV后脊尾白蝦血細(xì)胞中EcCatL基因的表達(dá)情況Figure 6 Expression of EcCatL gene in E. carinicauda hemocytes after V. anguillarum and WSSV injection

脊尾白蝦在注射感染鰻弧菌和WSSV后，肝胰腺中EcCatL基因的表達(dá)情況見(jiàn)圖7。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，鰻弧菌和 WSSV刺激后，肝胰腺中EcCatL的表達(dá)量都極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。其中，鰻弧菌感染組和WSSV感染組血細(xì)胞中EcCatL基因的表達(dá)量在注射早期(0～3 h)均出現(xiàn)下降，6～12 h開(kāi)始不斷上升，于12 h達(dá)到最高值，隨后逐漸下降；在24～48 h表達(dá)量開(kāi)始上升，并于48 h表達(dá)量極顯著的高于對(duì)照組(P＜0.01)；72 h后血細(xì)胞中 EcCatL基因的表達(dá)量逐漸回落至初始水平。肝胰腺中 EcCatL基因的表達(dá)量總體表現(xiàn)為下降、升高、再下降、再升高、最后下降至初始水平的趨勢(shì)。

圖7 注射鰻弧菌和WSSV后脊尾白蝦肝胰腺中EcCatL基因的表達(dá)情況Figure 7 Expression of EcCatL gene in E. carinicauda hepatopancreas after V. anguillarum and WSSV injection

3 討論

本研究首次克隆得到脊尾白蝦組織蛋白酶 L EcCatL基因序列，全長(zhǎng)1 136 bp，包含960 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)319個(gè)氨基酸組成的多肽。序列分析發(fā)現(xiàn)，與其他甲殼動(dòng)物的組織蛋白酶L一樣，EcCatL基因編碼的氨基酸序列含有半胱氨酸、組氨酸和天冬氨酸3個(gè)半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)以及半胱氨酸蛋白酶中高度保守的GNFD基序、重要結(jié)構(gòu)基序GCXGG基序和組織蛋白酶L家族高度保守的ERFNIN [E-X3-R-X2-(I/V)-F-X3-N-X3-I-X3-N]基序。與其它動(dòng)物氨基酸序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列與已知甲殼動(dòng)物的同源性較高，均＞80%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明脊尾白蝦與變色小長(zhǎng)臂蝦首先聚為一支，且與北極甜蝦、斑節(jié)對(duì)蝦和中華絨螯蟹等蝦蟹類的同源性＞50%。以上結(jié)果表明該序列為脊尾白蝦組蛋白酶L EcCatL基因。

研究報(bào)道表明，斑馬魚(yú)(Danio rerio)中發(fā)現(xiàn) 3種類型的組織蛋白酶L，合浦珠母貝(Pinctada fucata)中存在2種類型的組織蛋白酶L(Bai et al，2011)。本研究只發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦組織蛋白酶L的一種基因，是否存在其他類型，有待進(jìn)一步研究。ERFNIN基序是組織蛋白酶L家族的高度保守基序(Bai et al，2011)，其中4個(gè)氨基酸是最保守的，而苯丙氨酸F和異亮氨酸I在不同物種中有所變化，本研究脊尾白蝦組織蛋白酶L的ERFNIN基序的異亮氨酸I被纈氨酸V所取代，該特征與北極甜蝦一致 (圖4)；而中華絨螯蟹和阿拉斯加帝王蟹的苯丙氨酸F被酪氨酸Y所取代。GCXGG基序也是半胱氨酸蛋白酶非常重要的結(jié)構(gòu)基序(Bai et al，2011；Karrer et al，1993)，除中間的 X代表不同的氨基酸外，其它 4種氨基酸均保守，脊尾白蝦組織蛋白酶 L的GCXGG基序中X為天冬氨酸N，而南美白對(duì)蝦為甲硫氨酸M，中華絨螯蟹和阿拉斯加帝王蟹為甘氨酸G，刀額新對(duì)蝦為半胱氨酸C。本研究脊尾白蝦組織蛋白酶L重要基序的序列保守性和與其他物種相同的酶活性位點(diǎn)，表明脊尾白蝦組織蛋白酶L與其他物種組織蛋白酶L具有相似的蛋白功能。

脊尾白蝦EcCatL基因的表達(dá)具有組織特異性，Real time-PCR結(jié)果顯示，脊尾白蝦EcCatL基因在血細(xì)胞、鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢、腸、胃及眼柄中均有表達(dá)(圖5)。其中，在肝胰腺中的表達(dá)量最高，與中華絨螯蟹CatL基因組織表達(dá)情況一致(Li et al，2010)，在腸和眼柄中的表達(dá)量最少，說(shuō)明脊尾白蝦肝胰腺是參與組織蛋白酶 L儲(chǔ)存和釋放的主要器官。

免疫系統(tǒng)主要包括固有免疫和獲得性免疫兩大類(Salminen et al，2008)。無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏抗體介導(dǎo)的獲得性免疫，其機(jī)體免疫防御的發(fā)揮主要依靠其固有免疫系統(tǒng)，如血細(xì)胞的吞噬、包囊以及血淋巴中的一些酶和免疫因子的殺菌、抗菌作用，以此來(lái)識(shí)別和有效清除入侵的微生物和寄生蟲(chóng)等異物，保持體內(nèi)外平衡(Roch，1999)。組織蛋白酶L作為一種溶酶體蛋白，近年來(lái)在無(wú)脊椎動(dòng)物的先天免疫調(diào)控方面的研究取得了較大的進(jìn)展。De Gregorio對(duì)黑腹果蠅的研究表明，組織蛋白酶L表達(dá)量在細(xì)菌刺激后顯著上調(diào)，認(rèn)為組織蛋白酶L是一種參與機(jī)體免疫反應(yīng)的重要基因(Tisca & Mosca，2004)。在被WSSV感染后，組織蛋白酶L在凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明其參與了病毒防御過(guò)程(Zhao et al，2007)；在被鰻弧菌感染后，中華絨螯蟹CatL在血細(xì)胞中的表達(dá)量發(fā)生顯著性變化(Li et al，2010)；在被溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后，合浦珠母貝CatL1和CatL2的表達(dá)量出現(xiàn)急劇變化(Ma et al，2010a, b)。因此，組織蛋白酶L可能在細(xì)菌和病毒的防御過(guò)程中起著重要作用。

為了研究組織蛋白酶L在脊尾白蝦非特異性免疫防御中的作用，本研究設(shè)計(jì)了細(xì)菌(鰻弧菌)和病毒(WSSV)感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)感染后的脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺EcCatL表達(dá)量均有明顯的時(shí)間差異性，變化趨勢(shì)基本一致。注射鰻弧菌和WSSV后血細(xì)胞和肝胰腺中EcCatL的表達(dá)量均在12 h時(shí)達(dá)到最大值，與對(duì)照組相差異性極顯著(P＜0.01)，表明EcCatL可能參與了免疫反應(yīng)的應(yīng)答。刺激后 12～24 h EcCatL表達(dá)量下降，可能意味著機(jī)體處于感染后的恢復(fù)期(Sun et al，2010)。類似的基因表達(dá)情況也見(jiàn)于鰻弧菌刺激后的中華絨螯蟹(Li et al，2010)。注射鰻弧菌和WSSV后，脊尾白蝦血細(xì)胞EcCatL表達(dá)水平明顯高于肝胰腺，可能由組織器官功能差異性所致(Li et al，2012b)。血細(xì)胞是蝦類非特異免疫防御的首要組織，在病原體入侵后擔(dān)當(dāng)機(jī)體非特異免疫防御的重任，能夠比其他組織更迅速地上調(diào)EcCatL基因表達(dá)。

本研究成功克隆了脊尾白蝦 EcCatL基因全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)分析鰻弧菌和WSSV感染后脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中 EcCatL基因表達(dá)特征，可以進(jìn)一步認(rèn)定 EcCatL基因參與了脊尾白蝦的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在清除病原體的防御反應(yīng)中起著重要作用，為深入研究脊尾白蝦 EcCatL基因在病原體刺激下發(fā)揮免疫功能的途徑和機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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