史雨紅，章瑞程，楊旦陽，陸新江，陳 炯，李明云

寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室, 浙江 寧波 315211

白細(xì)胞衍生趨化因子 2 (leukocyte cell-derived chemotaxin 2, LECT2)是一個多功能細(xì)胞因子，參與肝移植及再生(Sato et al, 2004; Ohtomi et al, 2007)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Okumura et al, 2008)、腎淀粉樣病變(Larsen et al, 2010)以及腫瘤細(xì)胞生長和遷移(Ong et al, 2011)等多種病理和生理過程。近年來，魚類LECT2的研究發(fā)展迅速，且主要集中于其與病原微生物感染免疫反應(yīng)的相關(guān)性。目前已克隆了鯉魚(Cyprinus carpio) (Fujiki et al, 2000)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss, rainbow trout) (Bayne et al,2001)、斑馬魚(Danio rerio) (Lin et al, 2007)、大黃魚(Pseudosciaena crocea) (Li et al, 2008)、香魚(Plecoglossus altivelis) (Yang et al, 2009)、赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelus akaara) (Shi et al, 2010)、斜帶石斑魚(E. coioides) (Wei et al, 2011)和褐石斑魚(E. bruneus)(Harikrishnan et al, 2012)的LECT2基因。文獻(xiàn)報道揭示，斑馬魚在感染殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)后，肝臟LECT2基因mRNA表達(dá)量增加1000倍 (Lin et al, 2007)；大黃魚在感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后，肝臟LECT2基因mRNA表達(dá)量增加82.82倍，在脾臟中表達(dá)量增加58.56倍(Li et al,2008)；斜帶石斑魚感染金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)后，肝臟LECT2基因mRNA表達(dá)均上調(diào)(Wei et al, 2011)；褐石斑魚感染海豚鏈球菌(Strptococcus iniae)后，肝臟、脾臟和心臟LECT2基因mRNA表達(dá)量急劇上升(Harikrishnan et al, 2012)。新近，我們采用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn) LECT2能與一種免疫細(xì)胞上的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)—C型凝集素受體(C-type lectin receptor，CLR)(Chen et al, 2010 )相互作用，推測LECT2可能與魚類免疫細(xì)胞調(diào)控有關(guān)。

虹鱒不僅是重要的冷水性養(yǎng)殖魚類，也是魚類免疫學(xué)研究的重要實驗生物(Pérez-Sánchez et al,2011; Wenger et al, 2011)。本文采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)了虹鱒LECT2，采用柱層析方法分離純化目標(biāo)蛋白，并驗證其生物學(xué)活性，為相關(guān)蛋白的后續(xù)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌TOP10菌株、畢赤酵母X33和真核表達(dá)載體pPICZαA由本實驗室保存。AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA聚合酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0、限制性內(nèi)切酶EcoRI、KpnI和Sac I為 Takara公司產(chǎn)品；1 kb DNA ladder為Fermentas公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit為Omega公司產(chǎn)品；YPD培養(yǎng)基為Clontech公司產(chǎn)品；Zeocin、DMEM培養(yǎng)基和慶大霉素為Invitrogen公司產(chǎn)品；UNOsphere S陽離子交換柱和P6填料為Bio-rad公司產(chǎn)品；BCA-200蛋白含量測定試劑盒為 Pierce公司產(chǎn)品；含有 BSA的免疫原EDC試劑盒購自Thermo Scientific公司；二抗 (辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG) 為北京中山金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、顯影定影試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma 公司；趨化小室法為Corning公司產(chǎn)品。其他常規(guī)化學(xué)藥劑均為國產(chǎn)分析純。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 虹鱒LECT2 N端多肽的多克隆抗體制備

取虹鱒 LECT2 N端 20個氨基酸殘基(EDIENYTSLQEFTEDISHCG)，由吉爾生化(上海)有限公司合成多肽。再取合成多肽和BSA各5 mg，采用EDC法進(jìn)行偶聯(lián)。確定偶聯(lián)成功后，每7 d免疫注射小鼠1次，共注射3次。于最后一次注射3 d后眼動脈取血，4 ℃放置 6 h離心取血清，用于Western blot檢測。

1.2.2 重組虹鱒LECT2真核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已發(fā)表虹鱒LECT2基因序列(EMBL登錄號 AF363272) (Kokkinos et al, 2005)設(shè)計引物:pPI-rt-LECT2(+)/pPI-rt- LECT2(-) (表1)，擴(kuò)增片段為虹鱒LECT2去除信號肽的成熟蛋白(LECT2m)。取1 μg虹鱒肝臟總RNA為模板，oligo (dT)30為引物，42 ℃下AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成1.5 h，獲得第一鏈cDNA。以此為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分離純化后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I雙酶切后，插入相同酶切的pPICZαA載體，克隆獲得pPICZαA-LECT2m重組質(zhì)粒。

表1 實驗中所用引物Table 1 Primers used in the study

1.2.3 重組虹鱒LECT2基因在畢赤酵母X33中表達(dá)

采用電轉(zhuǎn)方法導(dǎo)入畢赤酵母X33中，轉(zhuǎn)化液涂布含Zeocin (100 μg/mL) YPDS培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng) 3～4 d。將這些轉(zhuǎn)化子點(diǎn)到 Zeocin含量分別為500、1 000、2 000 μg/mL的YPDS培養(yǎng)基上，篩選獲得高抗性工程菌株。取Zeocin高抗性菌株的菌落進(jìn)行菌落 PCR，引物為 pPI-rt-LECT2(+)/pPI-rt-LECT2(-)和5'AOX1/3'AOX1。高抗性工程菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)(Jin et al, 2011)，使畢赤酵母分泌表達(dá)重組虹鱒LECT2。

1.2.4 重組虹鱒LECT2的柱層析純化

收集1.2.3節(jié)中的培養(yǎng)上清，上樣至UNOsphere S陽離子交換柱，以3.0 mL/min的流速洗脫，洗脫液為1 mol/L 氯化鈉溶液。分段收集洗脫組分，并進(jìn)行 SDS-PAGE蛋白電泳及 Western blot檢測。Western blot檢測參考Huang et al (2011) 的方法，所用一抗為制備的虹鱒LECT2 N端多肽的多克隆抗體。最后將含有目的蛋白的洗脫組分用脫鹽層析柱(P6填料)脫鹽處理，目的組分真空冷凍干燥目的組分采用 BCA-200蛋白含量測定試劑盒測定總蛋白量，并用 12% SDS-PAGE 檢測純化效果，通過電泳條帶的積分光密度計算蛋白純度。

1.2.5 對巨噬細(xì)胞的趨化活性

健康虹鱒個體體重227～250 g，購自杭州近江農(nóng)都水產(chǎn)品市場。頭腎來源的巨噬細(xì)胞的分離參考Ryckaert et al (2010) 的方法，取虹鱒頭腎組織，100目篩網(wǎng)過濾后用培養(yǎng)基I(DMEM含5% 肽牛血清，1%非必需氨基酸和谷氨酰胺，100 mg/mL鏈霉素、青霉素和卡那霉素以及10 IU/mL肝素)沖洗細(xì)胞懸液。Percoll室溫梯度離心(400 r/min，25 min，4 ℃)，取位于密度為 34%～51%區(qū)域的細(xì)胞并用 DMEM洗滌，細(xì)胞計數(shù)及臺盼藍(lán)染色觀察后，細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基II (DMEM，不含抗性及肽牛血清，含0.1%熱滅活血清)中，細(xì)胞懸液濃度為1×106cells/mL。純化后的重組虹鱒 LECT2以及其高溫變性蛋白用培養(yǎng)基 II配制 5個濃度梯度(0、0.1、1、10、100 μg/mL)。利用趨化小室體外驗證重組蛋白的趨化活性，具體步驟見Zhang et al (2011)。吉姆薩染液染色后顯微鏡觀察，隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行計數(shù)，表示為mean±SD。趨化指數(shù)(chemotactic index, CI) 指細(xì)胞遷移到待測樣品液及對照液的數(shù)目比值。

1.2.6 對巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)的影響

采用 NBT法測定巨噬細(xì)胞呼吸暴發(fā)，具體方法見 Hsieh et al (2008)。虹鱒巨噬細(xì)胞(2×106cells/mL)中加入500 μL PBS (含 0.1% NBT，5 μg/mL LECT2) ，17 ℃孵育12 h后用400 μL甲醇終止反應(yīng)。產(chǎn)生的甲臜由 130 μL 2 M KOH 和 150 μL DMSO溶解。KOH/DMSO為空白對照，分別添加PBS(含 0.1% NBT)和 PBS(含 0.1% NBT，5 μg/mL BSA)與頭腎來源的巨噬細(xì)胞進(jìn)行孵育，作為空白對照和陰性對照。分光光度計在620 nm波長讀取光密度值。

1.2.7 對巨噬細(xì)胞殺菌能力的影響

虹鱒頭腎來源巨噬細(xì)胞(2×106cells/mL)經(jīng) 5 μg/mL LECT2預(yù)處理12 h后，與E. coli DH5α共培養(yǎng)，MOI為10。30 min后加入100 μg/mL慶大霉素除去培養(yǎng)基上清中未被吞噬的E. coli DH5α。此后，用含12.5 μg/mL慶大霉素的PBS清洗細(xì)胞。將該樣品分成兩組，一組細(xì)胞共培養(yǎng)后用 0.1%Triton X-100溶液裂解后在LB培養(yǎng)基上涂布，培養(yǎng)18 h，計算菌落數(shù)作為攝入細(xì)菌數(shù)；另一組加入無血清培養(yǎng)基后培養(yǎng)2 h，再裂解并在LB培養(yǎng)基上涂布，培養(yǎng)18 h，計算菌落數(shù)作為存活細(xì)菌數(shù)。存活率=(存活細(xì)菌/攝入細(xì)菌數(shù))×100。PBS和 PBS (5 μg/mL BSA)溶液處理頭腎來源巨噬細(xì)胞作為空白對照和陰性對照。

1.2.8 對巨噬細(xì)胞基因表達(dá)的影響

按1..2.5分離頭腎來源的巨噬細(xì)胞備用。將重組虹鱒LECT2配成溶液(5 mg/mL，培養(yǎng)基II)，取1 mL上述細(xì)胞懸浮液(1×106cells/mL)加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將 24孔板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱(17 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)24 h。用不含LECT2的培養(yǎng)基II作為陰性對照，對照組和實驗組分別設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中趨化因子2 (CC chemokine with stalk, CK2, AF418561)、CC趨化因子受體型9(CC chemokine receptor type 9, CCR9,NM_001124610)以及組織蛋白酶 D (Cathepsin D,Ctsd, U90321)設(shè)計擴(kuò)增引物(表 1)。mRNA 抽提、cDNA合成及熒光定量RT-PCR方法見Huang et al(2011)。

2 結(jié) 果

2.1 虹鱒LECT2真核表達(dá)載體構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)及純化

測序表明，pPICZαA-LECT2m重組質(zhì)粒插入片段開讀框正確，且與已獲得的虹鱒成熟LECT2基因核苷酸序列同源性為 100%。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33后，低抗培養(yǎng)基上得到＞1 432個轉(zhuǎn)化子。這些轉(zhuǎn)化子在1 000 μg/mL Zeocin的YPDS培養(yǎng)基上獲得 6個菌株。這些菌株用 pPI-rt-LECT2(+)/pPI-rt-LECT2(-)引物進(jìn)行菌落 PCR，均擴(kuò)增出 426 bp的條帶，而陰性對照中無擴(kuò)增條帶；用5'AOX1和3'AOX1引物擴(kuò)增出～1.0 kb LECT2表達(dá)單元和2.2 kb 的野生型AOX1基因。因此，這些克隆均為陽性重組工程菌株 X33/ pPICZαA-LECT2m。工程菌 X33/ pPICZαA-LECT2m 經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示一條誘導(dǎo)表達(dá)條帶，相對分子質(zhì)量為～15.9×103，與預(yù)測大小相符。

選擇6號工程菌進(jìn)一步擴(kuò)大誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)上清經(jīng)UNOsphere S陽離子交換柱分離后，出現(xiàn)雜峰和明顯主峰各一(圖1A)，分別命名為峰1和峰2，經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及Western blot檢測，確定峰2為目的組分重組虹鱒LECT2(圖1B，C)。經(jīng)脫鹽處理后，目的組分純度為96%，該重組工程菌株 X33/ pPICZαA-LECT2m 的表達(dá)水平為～120 mg/L酵母培養(yǎng)物。

2.2 重組虹鱒LECT2對巨噬細(xì)胞趨化活性驗證

當(dāng)重組LECT2濃度為0.1～1 μg/mL時，濃度越高，趨化活性越強(qiáng)，濃度為1 μg/mL時趨化指數(shù)(CI)達(dá)到 7.92，之后無顯著變化(圖 2)。重組虹鱒LECT2較其高溫變性蛋白對照組具有顯著的趨化活性 (圖2)。即純化的重組虹鱒LECT2對頭腎來源的巨噬細(xì)胞具有趨化活性，并在一定范圍內(nèi)具有濃度依賴性。

2.3 重組虹鱒LECT2對巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)和殺菌能力的影響

與陰性對照相比，添加5 μg/mL LECT2，OD值顯著升高3.1倍 (圖3A)，說明頭腎來源的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量超氧陰離子，將 NBT還原，呼吸爆發(fā)增強(qiáng) (P＜0.001)。5 μg/mL LECT2 處理虹鱒頭腎來源巨噬細(xì)胞12 h后，E. coli DH5α與細(xì)胞共培養(yǎng)30 min，測定E. coli DH5存活率。結(jié)果顯示，LECT2處理的頭腎來源巨噬細(xì)胞中E. coli DH5α存活率顯著下降，為陰性對照的0.51倍(圖3B)，說明LECT2處理使虹鱒頭腎來源巨噬細(xì)胞殺菌能力增強(qiáng)(P＜0.01)。

2.4 重組虹鱒LECT2對巨噬細(xì)胞基因表達(dá)的影響

為了驗證重組虹鱒 LECT2的對巨噬細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，我們參考了 Zhang et al(2011)的重組香魚 LECT2對頭腎來源巨噬細(xì)胞基因表達(dá)影響實驗，選擇了變化顯著的 CK2、CCR9以及Ctsd基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明，CK2、CCR9以及Ctsd基因 mRNA表達(dá)分別上調(diào)6.25、4.55及5.80倍 (圖4)。

圖2 不同濃度重組虹鱒LECT2和重組虹鱒LECT2變性蛋白對頭腎來源巨噬細(xì)胞趨化活性的影響 (n=3)Figure 2 Dose-response relationship of rainbow trout refolded and denatured-reduced LECT2 to attract head kidney-derived macrophages, respectively

圖3 重組虹鱒LECT2對頭腎來源單巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)(A)和殺菌能力(B)的影響Figure 3 Effects of rainbow trout LECT2 on respiratory burst activity (A) and bactericidal activity ofrainbow trout head kidney-derived macrophages (B)1：PBS，2：PBS (5 μg/mL BSA)，3：PBS (5 μg/mL LECT2)；n=3，**：P＜0.01，***：P＜0.001.

圖4 重組虹鱒LECT2對頭腎來源巨噬細(xì)胞CK2、CCR9和Ctsd表達(dá)的影響Figure 4 Effect of LECT2 on the expression of CK2, CCR9和Ctsd genes in primary cultured head kidney-derivedmacrophages of rainbow trout以 18 S rRNA 為內(nèi)參；n=4，**P ＜ 0.01; ***P ＜ 0.001。Relative expression levels of mRNA are normalized against 18S rRNA. n=4, **: P ＜ 0.01; ***: P ＜ 0.001.

3 討 論

本研究構(gòu)建了虹鱒 LECT2酵母真核表達(dá)載體pPICZαA-LECT2m，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)獲得目的蛋白，采用陽離子交換柱和分子篩層析方法進(jìn)行純化，獲得純度為96%，得率為120 mg/L酵母培養(yǎng)物目的蛋白。由于虹鱒LECT2的4個半胱氨酸，由兩對二硫鍵相連，呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Okumura et al, 2009)，其活性依賴于形成正確的二硫鍵并折疊成高級結(jié)構(gòu)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具備真核系統(tǒng)所特有的二硫鍵修飾作用，所表達(dá)的目的蛋白無需繁瑣的復(fù)性操作，有利于提高蛋白的穩(wěn)定性和活性蛋白得率。

LECT2最初因具有嗜中性粒細(xì)胞體外趨化活性，因而被定義為新型趨化因子(Yamagoe et al,1996)。本研究表明，重組虹鱒LECT2對頭腎來源巨噬細(xì)胞也具有趨化活性。這一結(jié)果與已報道的重組香魚LECT2的作用一致 (Zhang et al, 2011)。進(jìn)一步研究顯示，該重組蛋白可使巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)和殺菌能力增強(qiáng)。呼吸爆發(fā)是免疫細(xì)胞遇到免疫刺激物以后，氧消耗增加或者產(chǎn)生超氧離子而發(fā)生，而具有機(jī)體防御功能的一些細(xì)胞因子也可以誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)，諸如TNFα、IFNγ和IL-8 (Rieger et al,2011)。巨噬細(xì)胞直接殺滅病原微生物，一方面可以抑制病原微生物的生長，另一方面還可以將抗原遞呈給T細(xì)胞激活獲得性免疫 (Martinez-Pomares and Gordon, 2012)。巨噬細(xì)胞這兩種功能的增強(qiáng)，揭示LECT2不僅趨化巨噬細(xì)胞作定向移動，而且可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞清除病原菌的作用。在分子水平上進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞功能的發(fā)揮離不開細(xì)胞因子的分泌和調(diào)控。CK2是在虹鱒中發(fā)現(xiàn)的CC趨化因子，與CK1不同的是具有一個91氨基酸組成的柄狀結(jié)構(gòu)(Liu et al, 2002)。巨噬細(xì)胞分泌并參與宿主免疫防御過程，特別是炎癥反應(yīng)。CCR9為趨化因子CC亞族的受體，在介導(dǎo)趨化因子參與的免疫調(diào)節(jié)、器官形成、調(diào)節(jié)造血和神經(jīng)元通訊中起重要作用(Schmutz et al, 2010)。Ctsd是一種天冬氨酸類溶酶體的肽鏈內(nèi)切酶，在免疫識別和炎癥狀態(tài)等病理變化中具重要作用(Park et al, 2009)，它在魚類中的免疫相關(guān)性已得到證實。重組虹鱒 LECT2處理巨噬細(xì)胞后，這3個基因表達(dá)上調(diào)，與重組香魚LECT2的實驗結(jié)果一致(Zhang et al, 2011)。因此，魚類LECT2可能對頭腎來源的免疫細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述， 我們建立了虹鱒LECT2畢赤酵母表達(dá)及純化方法，該方法操作簡單，得率高，制備的虹鱒 LECT2具有生物學(xué)活性，可以用于后續(xù)功能研究。