羅 蘭 侯 杰 邱 冰 曹惠君 魏鳳香

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化一科，黑龍江 佳木斯 154002)

冬凌草甲素(ORI)是從唇形科香茶菜屬〔Rabdosia(Bl.)Hassk.〕植物中分得的一種貝殼杉烯二萜類化合物。冬凌草中主要抗癌活性成分是 ORI，其味道極苦〔1，2〕，具有清熱解毒、消炎止痛、抗腫瘤之功效，用于治療扁桃體炎、咽喉腫痛，對(duì)多種癌癥有緩解癥狀和延長(zhǎng)生存時(shí)間的作用，也可作為增強(qiáng)放化療療效的輔藥〔3〕。研究表明，ORI對(duì)20余種人癌細(xì)胞株生長(zhǎng)均有明顯的直接抑制作用〔4〕。前期工作表明 ORI對(duì)人胰腺癌SW1900細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl2-2表達(dá)的降低和促凋亡蛋白Bax上調(diào)是ORI體外誘導(dǎo)胰腺癌SW1900細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要作用機(jī)制之一〔5〕。磷酸化的組蛋白(H2AX)可以作為DNA損傷早期檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。本課題組觀察不同濃度的ORI注射劑誘導(dǎo)胰腺癌SW1900細(xì)胞的DNA損傷作用，并探討H2AX蛋白的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料 ORI由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所提供，用DMSO溶解(濃度≤0.1%)DMEM培養(yǎng)基;小牛血清(美國(guó)Gibco公司);H2AX(1∶100)，γ-H2AX(1∶100)，Phos-S1981ATM γ-H2AX(1∶100，Cell Signalling，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶1 000，Santa Cruz Biltechnology公司);β-actin(美國(guó)Santa Cruz公司)。低熔點(diǎn)瓊脂糖(德國(guó)Merck-Darmstadt公司)。EB(PI，美國(guó) Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌SW1990細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 彗星試驗(yàn) 參照Hockemeyer等〔6〕的方法改良。不同濃度的 ORI(20，40，80 μmol/L)處理 SW1900 細(xì)胞 48 h 后，收集2×106/ml細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次。制備0.5%的正常熔點(diǎn)瓊脂糖和0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖。取細(xì)胞懸液與0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻后加到預(yù)處理過(guò)的磨砂玻片上經(jīng)細(xì)胞裂解和DNA解旋后于4℃、25 V、300 mA條件下電泳25 min;經(jīng)過(guò)中和、蘇木素-伊紅(EB)染色、低溫避光，最后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)拖尾細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(彗星率)并測(cè)量拖尾細(xì)胞尾長(zhǎng)。每個(gè)樣本隨機(jī)測(cè)量100個(gè)彗星細(xì)胞的尾長(zhǎng)和300個(gè)細(xì)胞中彗星樣細(xì)胞的數(shù)目。

1.2.3 Western印跡檢測(cè)H2AX蛋白表達(dá) 不同濃度的ORI(20，40，80，160 μmol/L)處理 SW1900 細(xì)胞 48 h 后，收集 2 ×106/ml細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2次，在4℃裂解30 min，離心15 min，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。然后進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠分離，再進(jìn)行免疫印跡，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，浸沒(méi)于封閉液(含1%BSA的TBS)中搖蕩1 h.封閉后，進(jìn)行一抗孵育，將一抗按照推薦濃度溶于封閉液中，與對(duì)應(yīng)膜共同封閉在塑料袋中，4℃下過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST(TBS+0.1%Tween20)漂洗膜4次，每次15 min，再使用對(duì)應(yīng)的二抗孵育，按照相應(yīng)比例稀釋(1∶1 000～1∶10 000)，室溫輕搖 1 h，二抗孵育結(jié)束后，再用TBST漂洗膜4次，每次15 min，最后使用辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光顯色法(HRP-ECL)對(duì)膜進(jìn)行顯色曝光。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)γ-H2AX焦點(diǎn) 調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，按每孔2 ml的體積，接種細(xì)胞于6孔板中，設(shè)對(duì)照組和不同濃度的 ORI(20，40，80 μmol/L)處理 SW1900 細(xì)胞 48 h后，處理結(jié)束，4%多聚甲醛冰上固定，一抗室溫孵育2 h，加入熒光二抗37℃孵育1 h，4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)室溫孵育15 min。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察計(jì)數(shù)、采集圖像，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每張玻片至少計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析及直線相關(guān)回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組相比，不同濃度ORI處理的細(xì)胞彗尾長(zhǎng)度及彗星率增加(P＜0.01)，并隨著質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞彗尾長(zhǎng)度及彗星率增加，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。

表1 各組彗尾長(zhǎng)度與彗星率比較(±s，n=9)

表1 各組彗尾長(zhǎng)度與彗星率比較(±s，n=9)

與空白對(duì)照組比較:1)P＜0.05

組別 彗尾長(zhǎng)度 彗星率(%)空白對(duì)照組5.55±0.8 7.03±1.1 ORI組 20 μmol/L 19.96 ±4.81) 25.49 ±1.61)40 μmol/L 33.14 ±4.91) 51.12 ±1.11)80 μmol/L 43.12 ±4.651) 95.49 ±4.91)

2.2 ORI對(duì)SW1900細(xì)胞Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦點(diǎn)形成的影響 對(duì)照組幾乎沒(méi)有Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦點(diǎn)形成，各實(shí)驗(yàn)組Phos-S1981ATM和γ-H2AX的焦點(diǎn)數(shù)明顯增加。隨ORI濃度的增加，SW1900細(xì)胞平均焦點(diǎn)數(shù)和焦點(diǎn)細(xì)胞率呈逐漸增加趨勢(shì)(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 Western印跡結(jié)果 不同濃度的 ORI(DMSO，20，40，80 μmol/L)處理SW1900細(xì)胞48 h后結(jié)果表明，隨著濃度的增加，γ-H2AX蛋白水平呈逐漸增加趨勢(shì)(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 冬凌草甲素對(duì)SW1900細(xì)胞Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦點(diǎn)的影響(×1 000)

圖2 Western印跡結(jié)果

3 討論

H2AX是一類進(jìn)化上保守的組蛋白H2A的變體〔7〕。DSB的早期生物效應(yīng)標(biāo)志之一，就是組蛋白H2AX的快速和大量磷酸化，即形成γ-H2AX，γ-H2AX招募修復(fù)蛋白并在DSB周圍形成焦點(diǎn)，一個(gè)γ-H2AX焦點(diǎn)就代表著一處DSB，γ-H2AX的焦點(diǎn)數(shù)越多，表明細(xì)胞內(nèi)的DSB越多，γ-H2AX已成為檢測(cè)DSB的“金標(biāo)準(zhǔn)”〔8，9〕。因此，本研究選擇 γ-H2AX作為檢測(cè)指標(biāo)，分析了ORI對(duì)體外胰腺癌細(xì)胞DNA的損傷。

與其他一些常見(jiàn)的惡性腫瘤相比，胰腺癌的治療效果較差。外科手術(shù)仍然是最有可能為胰腺癌帶來(lái)治愈希望的治療手段，但是綜合治療必不可少。本研究免疫熒光和Western印跡結(jié)果表明，ORI作用濃度越高，細(xì)胞發(fā)生DSB的部位越多，這與ORI的抗腫瘤機(jī)制相佐證。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，當(dāng)ORI作用濃度增加，DNA損傷程度也增加，免疫熒光結(jié)果與彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。DNA損傷反應(yīng)是細(xì)胞應(yīng)對(duì)基因毒壓力所產(chǎn)生的反應(yīng)，包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡等，真核生物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)能夠正確復(fù)制并被精確傳到下一代，主要是由于細(xì)胞擁有一套有效的DNA損傷反應(yīng)機(jī)制。共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ATM)和Rad-3相關(guān)蛋白(ATR)激酶可以感知DNA損傷，并將DNA損傷信號(hào)傳導(dǎo)到下游靶蛋白，啟動(dòng)應(yīng)激系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯，從而完成DNA修復(fù)或啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序〔10～12〕，因此ATM和ATR對(duì)維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定和防止腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要。

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