蘇金玲 姜希娟 郭茂娟 馬東明 范英昌 (天津中醫(yī)藥大學病理教研室，天津 300193)

酒精性肝纖維化(AHF)是向酒精性肝硬化發(fā)展的必經(jīng)病理過程，Wnt信號通路參與調(diào)控細胞分化、癌變、凋亡及機體免疫、應激等病理生理過程。Wnt信號通路可促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，但其在AHF中的作用并不是很清楚，本文通過檢測Wnt信號通路的核心蛋白β連環(huán)蛋白(β-catenin)在AHF大鼠肝組織中的表達情況，探討Wnt信號通路在AHF中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar雄性大鼠60只，中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供〔許可證號:SCXK9(京)2005-0013〕，體重200 g左右。

1.2 主要實驗試劑 62°牛欄山二鍋頭:由北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn);吡唑:購自上海晶純試劑有限公司;Masson三色染色試劑盒:購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司;Ⅲ型膠原前蛋白(PⅢP)、層粘連蛋白(LN)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自美國RB公司;RNA提取試劑盒RNA-Solv Reagent購自Omega公司;SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組和模型制備 大鼠適應性飼養(yǎng)1 w，分為正常對照組(N組)30只、模型組(M組)30只。M組大鼠以62°牛欄山二鍋頭酒(10 ml·kg-1·d-1)、玉米油(2 ml·kg-1·d-1)、吡唑(25 mg·kg-1·d-1)混合物灌服，2次/d，早晚各1次。N組則2次/d以相應容量的生理鹽水灌服。兩組大鼠實驗期間均予全價營養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。造模12 w。

1.3.2 取材 于第12周末，所有大鼠禁食12 h，乙醚麻醉后，內(nèi)眥靜脈取血，離心后留取血清備用。頸椎脫臼處死大鼠后迅速剖腹取出肝臟，取肝右葉部分組織置于液氮中冷凍保存，以備檢測分子生物學指標之用，取肝左葉部分組織以10%中性甲醛溶液固定，以備檢測肝組織形態(tài)學指標。

1.3.3 指標觀察和檢測

1.3.3.1 Masson染色觀察肝組織纖維化的情況 按照試劑盒說明書嚴格操作。膠原纖維面積百分比的測定方法:每張切片選取四周及中央5個區(qū)域，均選取該區(qū)域膠原纖維含量最多的視野，應用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，10倍物鏡下測定膠原纖維面積百分比(膠原纖維面積/肝組織面積×100%)，取平均值。

1.3.3.2 酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測大鼠血清LN，PⅢP水平的變化 按試劑盒說明嚴格操作。

1.3.3.3 實時定量RT-PCR檢測β-catenin mRNA的表達 按照RNA提取試劑盒說明書提取大鼠肝組織總RNA，紫外分析及瓊脂糖電泳檢測總RNA的純度、濃度及完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以Random 6 mers和Oligo Dt Primer為引物將總RNA(500 ng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA(10 μl體系)。β-catenin的引物序列:正義鏈:5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3';反義鏈:5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。以GAPDH為內(nèi)參，其引物序列為:正義鏈:5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3';反義鏈:5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。PCR反應條件如下:第一步是預變性，95℃，30s(1個循環(huán))。第二步是PCR反應，95℃，5 s;60℃，31 s(40個循環(huán))。反應結束后，使用7300 system SDS software軟件分析PCR過程中樣本的CT值，每個標本設3個復孔，計算平均CT值，每一次反應均設定陰性對照。采用2-△△CT計算各目的基因相對反應起始拷貝數(shù)。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 實驗期間N組大鼠無1例死亡。M組大鼠死亡10只，其中因酒精誤入氣管死亡7只，因急慢性酒精中毒死亡3只。

2.2 Masson染色觀察肝組織纖維化情況 膠原纖維被染為藍色，N組大鼠肝組織中僅有少量膠原表達，主要位于匯管區(qū)、中央靜脈周圍〔(0.23±0.11)%〕;M組大鼠肝組織膠原纖維增生較明顯，尤其是中央靜脈周圍和匯管區(qū)部位，已經(jīng)有少量膠原從匯管區(qū)部分向肝小葉內(nèi)穿插〔(5.67±0.28)%〕。

2.3 大鼠血清LN、PⅢP的水平 M組大鼠血清LN和PⅢP水平較N組顯著升高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清LN和PⅢP水平(±s，ng/ml)

表1 各組大鼠血清LN和PⅢP水平(±s，ng/ml)

與N組比較:1)P＜0.01

組別 n LN PⅢP N組30 21.11±2.30 2.71±0.52 M組 20 75.65±1.191) 16.51±0.341)

2.4 大鼠肝組織β-catenin表達 M組β-catenin mRNA的表達比N組顯著升高〔(3.40±0.15)vs(1.06±0.12)，P＜0.01〕。

2.5 大鼠肝組織β-catenin mRNA表達與肝組織膠原面積及大鼠血清LN和PⅢP水平的相關性分析 β-catenin mRNA的表達與肝組織膠原面積及大鼠血清LN和PⅢP水平呈正相關(r=0.926，0.893，0.902，P ＜0.01)。

3 討論

AHF因其具有可逆性的特點，因此對AHF的機制研究并尋找治療AHF的有效靶點一直是國內(nèi)外研究的熱點。肝纖維化的病理學基礎為肝臟細胞外基質(zhì)(ECM)合成增加，降解減少導致肝組織內(nèi)膠原纖維過度沉積。

PⅢP是Ⅲ型前膠原裂解下來的氨基多肽，早在1979年Rohde等〔1〕首先建立了血清PⅢP的放免法，之后國內(nèi)外學者應用此方法對肝纖維化進行了大量研究，多數(shù)學者認為PⅢP是診斷肝纖維化較好的血清學指標。LN是細胞外基質(zhì)成分中一種重要的非膠原蛋白，在正常肝組織中無LN，當肝纖維化發(fā)生時，LN由肝內(nèi)的內(nèi)皮細胞和貯脂細胞合成，并與Ⅵ型膠原結合沉積在Disse腔形成基底膜，LN隨著肝纖維化的加重而合成增加。因此LN和PⅢP是檢測肝纖維化很敏感的指標〔2〕。

Wnt蛋白及其受體、調(diào)節(jié)蛋白等組成的復雜信號轉(zhuǎn)導通路，包括經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路〔3〕。目前研究比較深入的是Wnt經(jīng)典信號通路，也稱 Wnt/β-catenin 信號通路。Wnt/βcatenin信號是一個高度保守的信號通路，是調(diào)控細胞生長增殖的關鍵途徑。當經(jīng)典的Wnt信號途徑被激活后，Wnt蛋白與其細胞表面受體Frizzled家族跨膜蛋白結合，繼而Frizzled激活散亂蛋白(Dsh/Dvl)，Dsh再激活下游因子GSK-3β結合蛋白(GBP)，激活的GBP能識別并抑制GSK-3β的磷酸化活性，使β-catenin降解復合體失活，導致β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)的降解停止、蓄積并進入核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子TCF結合形成轉(zhuǎn)錄復合物，啟動下游靶基因的表達〔4〕。當Wnt信號活化引起β-catenin在細胞核內(nèi)聚集時，可作為該信號通路激活的標志〔5〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，造模12 w末，模型組大鼠肝組織膠原纖維面積以及血清PⅢP、LN水平高于N組，說明肝纖維化模型制備成功。另外M組大鼠肝組織Wnt信號核心蛋白β-catenin的表達較正常N組升高，并與肝組織膠原纖維面積以及血清PⅢP、LN成正相關，Wnt信號通路的啟動在AHF中同樣發(fā)揮重要的作用，但更為深入具體的機制有待進一步探討。

1 Rohde H.Radioimmunoassay for typeⅢprocollagen peptide and its application to human liver disease〔J〕.Eur J Chin Invest，1979;9(6):451.

2 劉芳蘭，梁碧珊，謝偉賢.透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、甘膽酸及Ⅲ型前膠原聯(lián)合檢測對肝纖維化早期的診斷價值〔J〕.江西醫(yī)藥，2005;40(6):328-9.

3 陶忠樺.Wnt信號轉(zhuǎn)導通路與組織器官纖維化〔J〕.西南軍醫(yī)，2005;12(3):531-3.

4 Moon RT，Kohn AD，De Ferrari GV，et al.Wnt and beta-catenin signalling:diseases and therapies〔J〕.Nature Rev Gene，2004;5(9):691-701.

5 Tolwinski NS，Wieschaus E.A Nuclear function for armadillo/beta-catenin〔J〕.PLoS Biol，2004;2(4):486-93.