雷榮劍， 李 軍， 金圣煊， 徐淑媛， 晏桂敏， 何俏軍

(1.浙江大學藥學院，浙江杭州310058;2.杭州創(chuàng)新中藥標準化研究所有限公司，浙江杭州310053)

高脂血癥是動脈粥樣硬化及相關疾病如冠心病、缺血性腦血管疾病和外周血管疾病的主要誘因?；颊咴谂R床上表現(xiàn)的特征為血清中總膽固醇(TC)、總甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白 (LDLC)的升高及高密度脂蛋白 (HDL－C)的降低［1］。目前臨床用于調(diào)節(jié)高血脂癥的藥物主要為他汀類，能顯著降低血清中 (LDL－C)等水平，其使用能大大降低心血管疾病發(fā)生的風險，然而，而單靠服用他汀類藥物并不能完全滿足臨床上所有患者對調(diào)節(jié)高血脂癥的需要，因為他汀類藥物的靶點比較單一，且他汀類藥物的過多服用也存在如皮疹等副作用［2］。藠頭Allium chinense G.Don，又名薤，記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是百合科蔥屬植物，它的干燥鱗莖作為薤白的藥用來源之一，被2010年版《中國藥典》收載［3］。藠頭除了作為藥食兩用作物在中國廣泛使用外，在世界上其他國家也廣泛應用于香料調(diào)味品和蔬菜［4］。藠頭既可食用又能入藥，具有多種藥理作用和保健功能，其中就包括對心血管疾病如高血脂、高血壓、高血糖癥的調(diào)節(jié)及在血小板聚集、血纖維蛋白溶解過程的調(diào)節(jié)作用［5］。研究表明甾體皂苷如薯蕷皂苷、番麻皂素、菝契皂苷及異菝葜皂苷類物質是百合科植物的主要活性成分，大多具有增加冠脈流量、營養(yǎng)心肌、改善外周循環(huán)、抑制血小板聚集及降低血清總膽固醇和甘油三酯等藥理作用［6－7］。目前僅有研究發(fā)現(xiàn)從藠頭中提取分離的甾體皂苷成分對環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶和Na+－K+－ATP 酶有抑制作用［8］，而對該成分在高脂血癥上起的調(diào)節(jié)作用未有報道，本文研究工作便以此為切入點，通過高脂飼料喂養(yǎng)誘發(fā)高脂大鼠模型，考察藠頭總甾體皂苷給藥后對其血脂水平、抗氧化能力、脂蛋白代謝酶和肝臟細胞形態(tài)的影響，從血清學、病理學等角度闡明藠頭總甾體皂苷對高脂血癥的調(diào)節(jié)機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 雄性SD大鼠，體質量約180 g，由浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

1.1.2 儀器與試藥 Agilent 1100系列高效液相色譜儀，DAD檢測器，甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇為分析純，水為自制重蒸水。菝葜皂苷元(中檢所，1539200001)。美國伯樂680酶標儀。藠頭鮮品，采自浙江新昌，經(jīng)浙江省醫(yī)學科學院助理研究員余陳歡鑒定為Allium chinense G.Don的干燥鱗莖;豬油自制，膽固醇 (國產(chǎn))，膽鹽，蛋黃;脂蛋白脂酶 (LPL)，肝酯酶 (HL)，谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH－Px)，超氧化物歧化酶 (SOD)，丙二醛 (MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 藠頭總甾體皂苷的制備 取500 g新鮮的藠頭，加10倍量 (質量比)的80%乙醇回流提取兩次，每次2 h，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至約200 mL(乙醇質量分數(shù)在10%以下)。濃縮液加蒸餾水300 mL稀釋后靜置過夜，取下層沉淀加150 mL水稀釋，加等量 (體積比)水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，減壓回收正丁醇并濃縮至干，殘留物加95%乙醇攪拌至溶解完全后，加丙酮至無沉淀產(chǎn)生，抽濾，取濾液濃縮后減壓干燥，得3 g左右白色干燥物，保存于4℃冰箱［9］。參考Miao等發(fā)表的文獻方法［10］，取少量干燥物進行Liebermann－Burchard顯色反應試驗，結果呈陽性，提示總甾體皂苷可能是白色干燥物主要成分。

1.2.2 HPLC分析 為了測定藠頭總甾體皂苷中甾體皂苷元的量，試驗采用反相高效液相色譜法:ZORBAX Extent－C18色譜 柱 (4.6mm × 250mm，5 μm)，柱溫30℃，以乙腈－水為流動相，乙腈為38%，體積流量1 mL/min，檢測波長204 nm，進樣量10μL。在HPLC測定前，將0.2 g總甾體皂苷溶解于20 mL 2 mol/L稀鹽酸并加熱回流2 h，冷卻后加40%氫氧化鈉至pH中性溶液，溶液用三氯甲烷萃取3次，每次25 mL，合并萃取液減壓回收三氯甲烷至干，殘渣加甲醇溶解并定容至25 mL量瓶，過0.45μm濾膜，供HPLC測定［11］。

1.2.3 動物實驗方法 取雄性SD大鼠48只，隨機分成6組，每組8只，即空白對照組、高血脂模型組、藠頭總甾體皂苷低劑量組 (50 mg/kg)，藠頭總甾體皂苷中劑量組(100 mg/kg)，藠頭總甾體皂苷高劑量組(200 mg/kg)，陽性藥洛伐他汀對照組 (2.5 mg/kg)。給予正常飼料1周后，除空白對照組給予正常飼料外，其他各組均用高脂飼料［12］(78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽)喂養(yǎng)，動物自由飲水。在給予高脂飼料4周后，空白對照組和模型組大鼠給予同量水，總甾體皂苷各給藥組及洛伐他汀對照組連續(xù)灌胃4周，每周稱量體質量1次。

1.2.4 血清測定及肝臟形態(tài)學觀察 在末次給藥后24 h，于10%水合氯醛麻醉 (35 mg/kg，腹腔注射)下，自大鼠腹主動脈取血，于3 000 r/min離心10 min后取血清，測定血清中總膽固醇 (TC)、總甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白 (LDL－C)、丙二醛 (MDA)、高密度脂蛋白 (HDL－C)、谷胱甘肽過氧化酶 (GSH－Px)和超氧化物歧化酶 (SOD)的水平。大鼠肝臟取出后，稱取200 mg肝組織加10%生理鹽水勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液測脂蛋白酯酶 (LPL)和肝脂酶 (HL)的水平。在肝臟最大葉距邊緣0.5 cm處取肝組織 (約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)用0.9%氯化鈉溶液沖洗，浸泡于10%福爾馬林溶液過夜，經(jīng)脫水、石蠟包埋及切片后得到約4μm的切片，用蘇木精染色后至光鏡觀察［13］。

2 結果

2.1 HPLC分析 因文獻報道菝葜皂苷元 (sarsasapogenin)為藠頭甾體皂苷的主要水解產(chǎn)物［14－15］，試驗擬采用菝葜皂苷元為對照品定量測定藠頭總甾體皂苷。色譜圖見圖1，樣品中菝葜皂苷元分離度良好 (18.988 min)，藠頭總甾體皂苷中菝葜皂苷元純度為8.2%。以菝葜皂苷元為對照品，經(jīng)香草醛－冰醋酸－高氯酸紫外顯色法測定藠頭總甾體皂苷純度為65.7%［16］。

圖1 總甾體皂苷高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of total steroidal saponins

2.2 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清TC、TG、LDL－C及HDL－C水平的影響 如表1所示，經(jīng)給藥4周后，與空白對照組比較，喂飼高脂飼料的模型組大鼠血清 TC、TG、LDL－C水平明顯增高 (P＜0.05)，分別增加115%、147%、93%，而HDL－C水平下降23%(P＜0.05)，提示高脂飼料喂養(yǎng)后的大鼠符合用于篩選治療藥物要求。與模型組比較，藠頭總甾體皂苷給藥組和洛伐他汀組對高脂飼料誘導的高血脂大鼠的TC、TG、LDL－C水平、動脈硬化指數(shù)AI［AI=(總膽固醇－高密度脂蛋白)÷高密度脂蛋白］均有降低作用，其中藠頭總甾體皂苷中劑量組和高劑量組給藥后不僅分別降低TC為33%和44%、TG為24%和42%、LDL－C為32%和38%(P＜0.05)，而且分別升高HDL－C為18%和24%(P＜0.05)。表明中、高劑量的藠頭總甾體皂苷給藥對高脂飼料喂養(yǎng)誘發(fā)的大鼠高脂血癥具有較好的調(diào)節(jié)作用。

表1 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響 (±s，n=8)Tab.1 Effects of total steroidal saponins on serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C in rats(±s，n=8)

表1 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響 (±s，n=8)Tab.1 Effects of total steroidal saponins on serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C in rats(±s，n=8)

注:與高血脂模型組相比較，*P＜0.05

組 別TC/(mmol·L －1)TG/(mmol·L －1)HDL－C/(mmol·L －1)LDL－C/(mmol·L －1)動脈硬化指數(shù)空白對照組 1.11±0.31* 0.86±0.08* 1.02±0.22* 0.67±0.11*0.09±0.02高血脂模型組 2.39±0.41 2.12±0.49 0.79±0.13 1.30±0.21 2.01±0.28陽性對照組 1.15±0.25* 1.23±0.13* 0.95±0.12* 0.73±0.27* 0.20±0.03*藠頭總甾體皂苷低劑量組 1.88±0.38 1.72±0.25 0.87±0.11 0.95±0.18* 1.16±0.31*藠頭總甾體皂苷中劑量組 1.60±0.20* 1.62±0.37* 0.93±0.15* 0.89±0.21* 0.72±0.22*藠頭總甾體皂苷高劑量組 1.33±0.24* 1.24±0.28* 0.98±0.21* 0.80±0.15* 0.37±0.09*

2.3 藠頭總甾體皂苷對大鼠肝臟HL和LPL水平的影響 HL和LPL在血清甘油三酸酯類物質清除中扮演重要角色，其中LPL作為脂肪分解酶能將甘油三酯、乳糜微粒中的磷脂、中密度脂蛋白等水解［17］。而HL作為肝細胞合成的脂肪分解酶對脂蛋白代謝也具有多方面影響，其活性與LDL和HDL顆粒存在的大小和密度相關［18－19］。如表2所示，空白組和模型組間的HL和LPL水平?jīng)]有顯著性差異。相比空白組，洛伐他汀組的LPL值略微升高，而HL值卻有所減少，與文獻報道一致［20］。藠頭總甾體皂苷給藥組的HL和LPL值顯著升高，其中藠頭總甾體皂苷高劑量組相對于空白、模型及洛伐他汀組，分別升高HL值 (39%，30%，53%)(P＜0.05)，升高 LPL值 (49%，28%，60%)(P＜0.05)。表明藠頭總甾體皂苷高劑量組給藥能提高高脂大鼠肝臟HL和LPL水平。

表2 藠頭總甾體皂苷對大鼠肝臟HL和LPL水平的影響(±s，n=8)Tab.2 Effects of total steroidal saponins on hepatic levelsof HL and LPL in rats(±s，n=8)

表2 藠頭總甾體皂苷對大鼠肝臟HL和LPL水平的影響(±s，n=8)Tab.2 Effects of total steroidal saponins on hepatic levelsof HL and LPL in rats(±s，n=8)

注:與高血脂模型組相比較，*P＜0.05

組 別HL/(U·mg prot－1)LPL/(U·mg prot－1)空白對照組1.23±0.19 0.93±0.17高血脂模型組 1.31±0.23 1.09±0.19陽性對照組 1.12±0.22 1.07±0.13藠頭總甾體皂苷低劑量組 1.44±0.25 1.17±0.19藠頭總甾體皂苷中劑量組 1.57±0.28 1.28±0.26*藠頭總甾體皂苷高劑量組 1.71±0.31* 1.39±0.27*

2.4 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清GSH－Px、MDA、SOD水平的影響 研究表明血液中存在的SOD/GSH－Px等抗氧化酶有助于清除體內(nèi)氧自由基和阻止脂質過氧化發(fā)生，而MDA是脂質過氧化的重要終末產(chǎn)物之一，其水平的多少預示脂質過氧化的速率和強度［21］。本實驗通過對血清 GSH－Px、MDA、SOD的測定，以進一步明確藠頭總甾體皂苷調(diào)節(jié)血脂的作用機制。如表3所示，與空白組相比，模型組的GSH－Px和SOD水平顯著降低。與模型組相比，藠頭總甾體皂苷給藥組的GSH－Px和SOD水平顯著升高，且呈劑量依賴性趨勢，其中藠頭總甾體皂苷高劑量組升高了GSH－Px和SOD水平分別為25%、23%(P＜0.05)。另一方面，模型組MDA水平顯著上升 (P＜0.05)，而相比模型組，藠頭總甾體皂苷和洛伐他汀組的MDA水平都呈下降趨勢，特別是中、高劑量的藠頭總甾體皂苷給藥顯著降低MDA水平 (P＜0.05)。以上結果表明藠頭總甾體皂苷給藥能提升大鼠體內(nèi)抗氧化酶水平及降低血清MDA水平。

表3 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清GSH-Px、MDA、SOD水平的影響 (±s，n=8)Tab.3 Effects of total steroidal saponins on serum levels of GSH-Px，MDA and SOD in rats(±s，n=8)

表3 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清GSH-Px、MDA、SOD水平的影響 (±s，n=8)Tab.3 Effects of total steroidal saponins on serum levels of GSH-Px，MDA and SOD in rats(±s，n=8)

注:與高血脂模型組比較，*P＜0.05

組 別GSH－Px/(U·mL－1)SOD/(U·mL－1)MDA/(nmol·mL －1)空白對照組 502±46.2* 425±43.5* 3.78±0.74*高血脂模型組 386±37.6 327±29.4 7.05±1.45陽性對照組 467±42.7* 406±41.8* 4.30±0.93*藠頭總甾體皂苷低劑量組 426±33.1 351±28.1 5.77±1.10*藠頭總甾體皂苷中劑量組 457±49.8* 382±43.3* 5.69±1.25*藠頭總甾體皂苷高劑量組 482±40.3* 401±46.0* 5.29±1.12*

2.5 肝臟形態(tài)學觀察 對各組大鼠的肝臟病理切片經(jīng)400倍放大觀察如圖2所示?？瞻讓φ战M少見脂肪滴存在。模型組肝細胞脂肪變性腫脹，肝細胞內(nèi)含有大小不等的脂肪滴。洛伐他汀對照組可見少量小脂肪滴存在。藠頭總甾體皂苷低劑量組可見比較多的小脂肪滴存在。藠頭總甾體皂苷中劑量組可見相對模型組較少的脂肪滴。藠頭總甾體皂苷高劑量組肝細胞內(nèi)脂肪滴較模型組明顯減少，多以小脂滴存在。以上結果說明藠頭總甾體皂苷中、高劑量組能改善高血脂癥大鼠的肝臟脂代謝，有效減少脂肪滴的產(chǎn)生，其結果與表1所測的血清學各項指標意義一致。

圖2 藠頭總甾體皂苷對高血脂癥大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 (400倍)Fig.2 Histopathological analysis of total steroidal saponins in the liver of the hyperlipidem ia rats(×400)

3 討論

本實驗以百合科蔥屬植物具有多種藥理作用和保健功能為依據(jù)，對藥食兩用植物藠頭在高脂血癥上起的調(diào)節(jié)作用進行實驗研究，結果表明藠頭中甾體皂苷成分能有效調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠多項血脂水平，提高其體內(nèi)部分脂肪分解酶及抗氧化酶水平，有效減少脂肪滴的產(chǎn)生，改善高血脂癥大鼠的肝臟脂代謝。然而，僅以大鼠模型對藠頭甾體皂苷成分進行實驗研究還是不夠的，如增加其他模型如轉基因小鼠等進行深入研究，則對闡明藠頭甾體皂苷成分調(diào)血脂的多靶點作用機理有積極意義，故在下一步研究中應予以重視。

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