吳 瓊 于寒松，2 張 嵐 劉俊梅，2 王玉華，2 常 鑫 胡耀輝，2

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，長(zhǎng)春 130118)

(國(guó)家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心加工研究室2，長(zhǎng)春 130118)

(吉林醫(yī)藥學(xué)院3，吉林 132000)

豆乳是人類重要的植物蛋白資源，富含優(yōu)質(zhì)蛋白［1］。由于大豆蛋白的氨基酸譜與人類的需求密切相關(guān)，因此它比任何一種植物蛋白對(duì)人體都有益［2］。益生菌是指投入后通過(guò)改善宿主腸道菌群生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高宿主(人和動(dòng)物)健康水平和健康佳態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物。目前，最常見(jiàn)的益生菌基本都屬于乳酸菌和兩歧雙岐桿菌菌屬［3－4］。

由于植物乳桿菌產(chǎn)生蛋白酶、有機(jī)酸等物質(zhì)，不僅可將大豆中蛋白質(zhì)、膳食纖維、低聚糖等大分子物質(zhì)分解成小分子，將一些不溶性大分子化合物分解成可溶性小分子化合物，實(shí)現(xiàn)所謂的預(yù)消化作用，從而有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化吸收，而且使鈣轉(zhuǎn)化成乳酸鈣，成為可溶性鹽，從而大大的提高了鈣的吸收率［5－7］。兩歧雙岐桿菌是人體內(nèi)主要的雙岐桿菌之一［8］，是自然棲居在人體腸道中的有益菌株，其主要作用有抑制有害菌群、維持腸道菌群平衡和保護(hù)腸道;代謝中產(chǎn)生有機(jī)酸、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、腹瀉便秘雙重調(diào)節(jié)［9］。因此，利用益生菌發(fā)酵豆乳可顯著增加大豆制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

目前，未見(jiàn)針對(duì)植物乳桿菌和兩歧雙岐桿菌混合菌種發(fā)酵豆乳的報(bào)道，本試驗(yàn)將對(duì)植物乳桿菌、雙岐桿菌、混合菌種發(fā)酵前后豆乳營(yíng)養(yǎng)成分變化進(jìn)行比較分析，以期為發(fā)酵豆乳研究奠定良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆:市售。兩歧雙岐桿菌、植物乳桿菌:本研究室自用保藏菌種。

硫酸、硼酸、鹽酸、甲基紅、硫酸銅、溴甲酚綠、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀等。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

SW－CJ－1F超凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DHP120恒溫培養(yǎng)箱:上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;LDZX－50KBS立式電熱壓力蒸氣鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;infinitieM200酶標(biāo)儀:NanoQuant;TL－18M高速臺(tái)式離心機(jī):上海離心機(jī)研究所;UV－2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼柯(上海)有限公司;L－8800氨基酸自動(dòng)分析儀:日本日立。

1.3 方法

1.3.1 豆乳的制作工藝

挑選大豆→脫皮→浸泡→磨漿→膠體磨→帶渣煮漿→過(guò)濾→分裝→滅菌→冷卻→成品

1.3.2 發(fā)酵豆乳的制備

按1.3.1制作豆乳，其中分別接入植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌和混合菌種。接種量均為10%，混合菌種比例為植物乳桿菌∶兩歧雙岐桿菌 =1∶1，于37℃發(fā)酵。發(fā)酵后將豆乳在－45℃條件下真空冷凍干燥，待用。

1.3.3 發(fā)酵豆乳中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

凱氏定氮法［10］。

1.3.4 發(fā)酵豆乳中蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定

SDS－PAGE凝膠電泳。濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為 12%［11］。

1.3.5 發(fā)酵豆乳中小肽含量的測(cè)定

75%乙醇沉降法［12］。

1.3.6 發(fā)酵豆乳中氨基酸含量的測(cè)定

采用氨基酸自動(dòng)分析儀［13］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

平均值和標(biāo)準(zhǔn)差由3個(gè)樣品的測(cè)量結(jié)果經(jīng)計(jì)算得到，數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行方差分析，并且應(yīng)用Excel進(jìn)行常規(guī)數(shù)據(jù)處理。。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵豆乳可溶性蛋白質(zhì)含量比較

采用兩歧雙岐桿菌和植物乳桿菌對(duì)豆乳進(jìn)行單菌種和復(fù)合菌種發(fā)酵后，樣品中蛋白質(zhì)含量如圖1。

圖1 發(fā)酵豆乳蛋白質(zhì)含量變化

植物乳桿菌、雙岐桿菌7～12 h為菌種生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，因此單菌種發(fā)酵采用7～12 h進(jìn)行測(cè)定，混合菌種在5～12 h菌體活力最強(qiáng)，因此選擇5～12 h進(jìn)行測(cè)定。由圖1可知在發(fā)酵過(guò)程中豆乳本身氮元素含量沒(méi)有發(fā)生變化，因此單菌種和混合菌種發(fā)酵時(shí)蛋白質(zhì)含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，基本沒(méi)有變化。但接入菌種后由于菌體中含有蛋白質(zhì)，導(dǎo)致豆乳中引入了新的氮元素，因此，在接入菌種初期豆乳蛋白質(zhì)含量增加，之后保持平穩(wěn)狀態(tài)。

2.2 發(fā)酵豆乳蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布比較

發(fā)酵豆乳中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布分析結(jié)果見(jiàn)圖2～圖4。

由圖2～圖4蛋白質(zhì)電泳圖譜可見(jiàn)，未發(fā)酵的豆乳蛋白有8條蛋白條帶，分子質(zhì)量分別為200、80、70、40、35、30、20、14 ku;植物乳桿菌與兩歧雙岐桿菌混合發(fā)酵12 h后，豆乳中僅剩5條蛋白條帶，分子質(zhì)量分別為 35、30、20、14、6.5 ku。由于在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生一系列蛋白酶，將大分子蛋白降解為小分子蛋白，與未發(fā)酵豆乳比較，分子質(zhì)量為200和80 ku的蛋白質(zhì)明顯降解，在12 h之后幾乎消失，由于大分子蛋白的降解，蛋白分子質(zhì)量35 ku左右的條帶加粗，表明35 ku分子質(zhì)量蛋白質(zhì)有所增加，且小分子質(zhì)量條帶表達(dá)稍有增加;兩歧雙岐桿菌與混合菌種發(fā)酵豆乳變化趨勢(shì)基本相似，發(fā)酵12 h后有6條蛋白條帶，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為 35、30、25、23、20、15 ku，由于兩歧雙岐桿菌發(fā)酵也產(chǎn)生一定量的蛋白酶，因此，小分子質(zhì)量的蛋白條帶有所增加。植物乳桿菌發(fā)酵豆乳12 h后，有5條蛋白條帶，蛋白分子質(zhì)量分別為35、30、25、20、15 ku。蛋白分子質(zhì)量為 200 和80 ku左右的條帶經(jīng)發(fā)酵后明顯降解，35 ku左右的條帶出現(xiàn)微弱的降解，且小分子質(zhì)量條帶稍有增加。由此可以推測(cè)，發(fā)酵后大分子蛋白經(jīng)蛋白酶降解為小分子蛋白。

2.3 發(fā)酵豆乳小肽含量比較

采用兩歧雙岐桿菌和植物乳桿菌進(jìn)行單菌種和復(fù)合菌種制備發(fā)酵豆乳中小肽分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵豆乳小肽含量變化

由圖5可知，植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌和混合菌種發(fā)酵豆乳過(guò)程中小肽含量隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，小肽含量最高出現(xiàn)在10 h，小肽含量分別比未發(fā)酵豆?jié){增加了19.4%、22.16%和27.12%，通過(guò)SPSS 12.0軟件分析后，混合菌種、植物乳桿菌和兩歧雙岐桿菌發(fā)酵豆乳發(fā)酵中小肽含量最大值與未發(fā)酵豆乳中小肽含量均差異極顯著(P＜0.000);混合菌種發(fā)酵豆乳分別與植物乳桿菌和雙岐桿菌發(fā)酵豆乳進(jìn)行比較，小肽含量最大值與兩者均差異極顯著(P＜0.000)，植物乳桿菌和雙岐桿菌發(fā)酵豆乳比較，兩者小肽含量最大值差異不顯著(P＞0.1)。

2.4 兩歧雙岐桿菌和植物乳桿菌單菌種發(fā)酵與混合發(fā)酵豆乳氨基酸含量比較

采用兩歧雙岐桿菌和植物乳桿菌對(duì)豆乳進(jìn)行單菌種和復(fù)合菌種發(fā)酵后，分析樣品中天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸等16種氨基酸，其中變化明顯的氨基酸結(jié)果見(jiàn)表1～表3。

由表1～表3可知，植物乳桿菌發(fā)酵豆乳時(shí)間為10 h時(shí)總氨基酸含量達(dá)到最高，與未發(fā)酵豆乳相比增加了8.22%。兩歧雙岐桿菌發(fā)酵豆乳時(shí)間為7 h時(shí)總氨基酸含量達(dá)到最高，與未發(fā)酵豆乳相比增加了10.61%?；旌暇N發(fā)酵時(shí)間為12 h時(shí)總氨基酸含量達(dá)到最高。由于混合菌種發(fā)酵前期消耗的氨基酸較多，因此氨基酸含量有所偏低，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間12 h時(shí)氨基酸含量達(dá)到最高。與未發(fā)酵豆乳相比增加了9.95%。

表1 植物乳酸發(fā)酵豆乳氨基酸變化/%

表2 雙岐桿菌發(fā)酵豆乳氨基酸變化/%

表3 混合菌種發(fā)酵豆乳氨基酸的變化/%

3 討論與結(jié)論

本研究菌種選取植物乳桿菌和兩歧雙岐桿菌作為發(fā)酵的菌株，由于兩歧雙岐桿菌可以抑制蠟樣芽孢桿菌等腐敗菌繁殖［14］，植物乳桿菌可以產(chǎn)生共軛亞油酸、低聚糖、蛋白酶、有機(jī)酸等有益人體生命活動(dòng)的物質(zhì)［15］，因此將兩種菌株進(jìn)行混合發(fā)酵豆乳，并且兩者混合后可保證在4 h達(dá)到凝乳。本研究從蛋白質(zhì)的含量、分子質(zhì)量、小肽、氨基酸方面比較了植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌單菌種發(fā)酵和混合菌種發(fā)酵豆乳的變化。由于植物乳桿菌、雙岐桿菌7～12 h為菌種生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，因此單菌種發(fā)酵采用7～12 h進(jìn)行測(cè)定，混合菌種在5～12 h菌體活力最強(qiáng)，因此選擇5～12 h進(jìn)行測(cè)定。

由于接入菌種后菌體中含有蛋白，導(dǎo)致豆乳在植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌、混合菌種發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)含量增加，隨后蛋白質(zhì)含量基本保持恒定。

未發(fā)酵豆乳蛋白有8條蛋白條帶，由于在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生一定量的蛋白酶，這些蛋白酶將大分子蛋白質(zhì)分解成小分子蛋白質(zhì)，因此混合菌種發(fā)酵豆乳12 h后有5條蛋白條帶，未發(fā)酵豆乳中分子質(zhì)量為200和80 ku蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)發(fā)酵后明顯降解，在12 h之后幾乎消失;蛋白分子質(zhì)量35 ku左右的條帶出現(xiàn)加粗趨勢(shì)，且小分子質(zhì)量條帶表達(dá)稍有增加。雙岐桿菌與混合菌種發(fā)酵豆乳變化基本相似，發(fā)酵12 h后有6條蛋白條帶，植物乳桿菌發(fā)酵豆乳12 h后，有5條蛋白條帶。研究表明豆乳中呈現(xiàn)豆腥味的脂肪氧化酶分子質(zhì)量為80 ku［16］，由于本文采用植物乳酸菌、兩歧雙岐桿菌單菌種和混合菌種發(fā)酵豆乳中蛋白分子質(zhì)量為200和80 ku左右的條帶經(jīng)發(fā)酵后明顯降解，因此豆腥味明顯下降。這為益生菌發(fā)酵有助于減弱豆腥味的形成，改善發(fā)酵制品的風(fēng)味提供了理論依據(jù)。此結(jié)果與楊媚［16］采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵豆乳蛋白質(zhì)分子質(zhì)量80 ku左右條帶明顯降解，小分子質(zhì)量條帶表達(dá)稍有增加的結(jié)果相符，而本試驗(yàn)采用的雙岐桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵后大分子條帶基本全部降解，說(shuō)明降解蛋白質(zhì)能力較高，發(fā)酵后的豆乳大分子蛋白變?yōu)樾》肿拥鞍赘妆蝗梭w吸收。

在植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌、混合菌發(fā)酵豆乳產(chǎn)生的蛋白酶作用下將蛋白質(zhì)分解成小肽，使得小肽含量分別增加了19.4%、22.16%和27.12%。

發(fā)酵豆乳的氨基酸在種類上并沒(méi)有增加，但是在含量上都有不同程度的變化，氨基酸總含量分別增加了9.95%、8.22%和 10.61%。與 Song 等［17］用雙岐桿菌Bb12、酵母菌IFJ87發(fā)酵大豆粉中氨基酸總含量分別增加了0.74%、9.06%相比，本試驗(yàn)中植物乳桿菌和兩歧雙岐桿菌混合發(fā)酵后氨基酸總含量略高，各種氨基酸含量均不同程度增加。特別是纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸分別增加了8.02%、10.85%、8.15%。以上結(jié)果表明，益生菌發(fā)酵之后對(duì)豆乳大分子蛋白質(zhì)起到了預(yù)消化作用，同時(shí)有效降低了豆乳的豆腥味，改善了豆乳的風(fēng)味。

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