黃 薇 宋永康 余 華 田寶玉

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，福州 350003)

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院工業(yè)微生物教育部工程研究中心2，福州 350108)

利用生物催化技術(shù)將低值的蛋白源轉(zhuǎn)化成多肽、寡肽等高值蛋白原料的方法是目前大豆蛋白開發(fā)利用的新方法［1］。大豆蛋白水解后，形成各種不同分子質(zhì)量大小的多肽，研究表明蛋白水解物的營養(yǎng)價(jià)值和功能特性與肽段的分子質(zhì)量大小密切相關(guān)［2－4］。同時(shí)在水解生成的多肽混合物中，分子質(zhì)量分布可以反應(yīng)蛋白質(zhì)的水解程度、多肽的分子質(zhì)量以及多肽含量分布。因此，建立一種能快速測定大豆蛋白酶解產(chǎn)物中多肽分子質(zhì)量分布的方法具有十分重要的意義。

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)是測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量最常用的方法。但常規(guī)Tris－Glycine－SDS－PAGE電泳分析分辨大分子物質(zhì)的分子質(zhì)量范圍在10～200 ku，對(duì)小于10 ku的小分子多肽分辨率低，常出現(xiàn)條帶擴(kuò)散丟失、無色帶等問題。Sch gger［5］應(yīng)用三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)代替甘氨酸作為終止離子，能夠有效分離小分子蛋白、多肽。但近年來文獻(xiàn)報(bào)道，使用Tricine－SDS－PAGE分離小分子肽的樣品多為低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品或者小分子蛋白［6－9］，而對(duì)酶解產(chǎn)物小分子肽蛋白的分離鮮見報(bào)道。在分離大豆酶解產(chǎn)物的實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，Tricine－SDS－PAGE分離效果與樣品上樣量、凝膠系統(tǒng)、緩沖液系統(tǒng)以及染色方法等密切相關(guān)。試驗(yàn)對(duì)大豆酶解肽蛋白Tricine－SDS－PAGE分離的主要影響條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一種效果理想、簡便靈敏的適合檢測大豆酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的分離體系，為提高大豆酶解技術(shù)水平以及深入研究特定分子質(zhì)量大豆多肽的生理活性與功能特性提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

1.1.1 主要試劑

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)83.29%):福州科匯生物技術(shù)有限公司;Alcalase堿性蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶、Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶:丹麥Novozymes公司;Protex.7L細(xì)菌中性蛋白酶:杰能科(中國)生物工程有限公司;胰蛋白酶:美國 Aeresco公司;木瓜蛋白酶:福州?？乒?40%(質(zhì)量體積比)Acryl/Bis(29∶1)溶液、40%(質(zhì)量體積比)Acryl/Bis(19∶1)溶液、三羥甲基氨基甘氨酸(Tricine)、過硫酸胺、尿素、Tris堿、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、TEMED、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán) G250、考馬斯亮藍(lán)R250:上海生物工程有限責(zé)任公司;低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品:美國 Thermo公司;對(duì)苯二甲醛(OPA)、氫氧化鈉、鹽酸、戊二醛、甘油、乙二醇等其他常用試劑:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器

Kjeltec 2300自動(dòng)定氮儀:瑞典Foss有限公司;U－3900紫外分光光度計(jì):日本Hitachi公司;PHS－3C pH酸度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;Mini－PROTEAN 3電泳系統(tǒng):美國Biorad公司;Avanti－J25高速離心機(jī):美國BACKMAN公司;MilliQ－Water純水儀:美國Millipore公司;TS－1型脫色搖床:江蘇海門市其林貝爾儀器有限公司。

1.1.3 溶液配制

10 ×電泳緩沖液:1 mol/L Tris，1 mol/L Tricine，1%SDS，pH 8.3。3 × 凝膠緩沖液:3 mol/L Tris，1 mol/L HCl，0.3%SDS。2 × 上樣緩沖液 1:60%甘油，4%SDS，0.2% 溴酚藍(lán)，3%DTT。2 × 上樣緩沖液2:40% 甘油，4%SDS，0.2% 溴酚藍(lán)，3%DTT。2×上樣緩沖液3:20%甘油，4%SDS，0.2%溴酚藍(lán)，3%DTT。固定液:5%戊二醛?？捡R斯亮藍(lán)R－250染色液:0.1%考馬斯亮藍(lán)R－250，25%異丙醇，10%冰醋酸?？捡R斯亮藍(lán)G－250染色液:0.1%考馬斯亮藍(lán) G－250，25%異丙醇，10%冰醋酸。脫色液:10%冰醋酸，5%乙醇。

1.2 方法

1.2.1 大豆蛋白酶解液的制備

稱取大豆分離蛋白1 g，按1∶50固液比加入蒸餾水，用1.0 mol/L NaOH 或1.0 mol/L HCl調(diào) pH 至酶反應(yīng)最適pH，按加酶量3 000 U/g加入蛋白酶、置于酶的最適溫度下水解30 min后，酶解液置于沸水浴中滅酶10 min，離心取上清液，保存在4℃待分析用。大豆酶解肽電泳分離條件的建立采用Alcalase酶解大豆蛋白液。本試驗(yàn)所選用的蛋白酶及其性質(zhì)見表1。

表1 試驗(yàn)所選蛋白酶的性質(zhì)

1.2.2 水解度的測定

水解度(DH，Degree of Hydrolysis)的定義是指蛋白質(zhì)水解過程中，被斷裂的肽鍵數(shù)h(mmol/g蛋白質(zhì))與給定蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)htot(mmol/g蛋白質(zhì))之比。水解度的測定方法采用鄰苯二甲醛(OPA)法［10］。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測定

蛋白質(zhì)含量依據(jù)GB/T 5009.5—2010微量凱氏定氮法，采用Foss Kjeltec 2300自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測定。

1.2.4 Tricine－SDS － PAGE

依據(jù)郭堯君［11］的方法，按表2給出的數(shù)據(jù)灌制分離膠和濃縮膠，加入1×電泳緩沖液，上樣，200 V電泳約2 h，電泳結(jié)束后，用雙蒸水把膠面洗凈，置于新鮮配制的5%戊二醛溶液中固定30 min，然后用雙蒸水洗凈膠面5 min，置于染色液中水浴60℃染色15 min，再置于脫色液中水浴60℃脫色，脫色后的凝膠用凝膠成像及分析系統(tǒng)拍照并分析。

表2 膠的配制

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆蛋白酶解產(chǎn)物的水解度及可溶性蛋白含量分析

對(duì)不同蛋白酶水解大豆分離蛋白所得酶解液的水解度和可溶性蛋白含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)表明，不同蛋白酶的水解大豆分離蛋白的能力還是有顯著差異的。水解30 min，水解度最高的為 Protamex，達(dá)到 17.65%，其次是胰蛋白酶(16.95%)＞風(fēng)味蛋白酶(15.85%)＞Protex.7L(15.39%)＞ 木瓜蛋白酶(15.16%)＞Alcalase(14.69%)。酶解液中可溶性蛋白含量最高的是胰蛋白酶(20.61 mg/mL)，其次是Flavourzyme(19.22 mg/mL)＞ Protamex(18.65 mg/mL)＞ Protex.7L(18.43%)＞Alcalase(12.47%)＞木瓜蛋白酶(12.41%)。考慮到Alcalase為來自微生物的內(nèi)切蛋白酶，作用位點(diǎn)廣泛，因而采用Alcalase酶解液來建立大豆酶解肽Tricine－SDS－PAGE的分離條件。

表3 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的多肽得率

2.2 不同凝膠系統(tǒng)對(duì)分離效果的影響

為了達(dá)到理想的分離效果，本試驗(yàn)用4種不同凝膠系統(tǒng)對(duì)大豆酶解液的分離效果進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，這4種不同組成的凝膠電泳基本上都能分離分子質(zhì)量4.6 ku以上的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和10 ku以上的大豆多肽，但分離1.7 ku的低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和10 ku以下的大豆多肽時(shí)，電泳圖譜不盡相同。從圖1a～圖1b中可以看出，交聯(lián)度為5%時(shí)的分離酸能夠使凝膠分子結(jié)構(gòu)更致密，更有利于小分子肽的分離，帶型更清晰。甘油膠(圖1a～圖1b)不能分離1.7 ku的低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和10 ku以下的大豆多肽;尿素膠(圖1c)能改善小分子的分離效果，但4.6 ku與1.7 ku的低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品條帶緊靠，不能完全分離，且對(duì)10 ku以下的大豆多肽分離效果欠佳;乙二醇膠(圖1d)分離1.7 ku的效果很好，并可以分離分子質(zhì)量低至1.7 ku的大豆多肽。

圖1 不同凝膠系統(tǒng)的Tricine－SDS－PAGE圖譜比較

2.3 不同上樣緩沖液對(duì)分離效果的影響

合適的電泳緩沖液能保持蛋白質(zhì)在電泳系統(tǒng)中的溶解性能和穩(wěn)定性能［12］。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大豆多肽在上樣緩沖液甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)少于30%時(shí)，跑出的蛋白電泳條帶帶型兩頭偏下，中間偏高，且?guī)湍：?，成皺眉現(xiàn)象(如圖2所示)。這可能是由于大豆蛋白酶解肽的密度較小，不易下沉，容易擴(kuò)散。

圖2 不同上樣緩沖液的Tricine－SDS－PAGE圖譜比較

2.4 不同上樣量對(duì)分離效果的影響

電泳的分辨率是有限的，上樣量過高易造成水平拖尾并出現(xiàn)過飽和現(xiàn)象，過低則導(dǎo)致一些低豐度的蛋白質(zhì)不能被檢測到，所以選擇合適的上樣量很重要。本研究選擇了20、30、40和50 μg 4個(gè)不同的上樣量。從Tricine－SDS－PAGE圖譜的分離效果來看，20 μg 上樣量優(yōu)于 30、40 和 50 μg。當(dāng)上樣量超過20 μg時(shí)，出現(xiàn)擠壓泳道，濃縮不完全，條帶模糊，出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，甚至嚴(yán)重影響相鄰泳道的分離。因此，對(duì)于大豆蛋白酶解肽Tricine－SDS－PAGE，上樣量在20 μg較合適。

圖3 不同上樣量的Tricine－SDS－PAGE圖譜比較

2.5 不同染色方法對(duì)分離效果的影響

在蛋白染色方法中，目前以考馬斯亮藍(lán)染色最為常用。本試驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)R－250和考馬斯亮藍(lán)G－250 2種染色方案對(duì)大豆酶解肽Tricine－SDS－PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行了染色(圖4)。從圖4可以看出，考馬斯亮藍(lán)R－250染料對(duì)分子質(zhì)量大的多肽結(jié)合力較強(qiáng)，而對(duì)小分子多肽的結(jié)合力較弱，易擴(kuò)散沖洗掉而著色較差;而考馬斯亮藍(lán)G－250染料對(duì)小分子多肽的結(jié)合力較強(qiáng)，能夠提高大豆小分子多肽電泳的分辨率，小分子蛋白帶更為清晰。

圖4 不同染色方法的Tricine－SDS－PAGE圖譜比較

2.6 不同蛋白酶酶解液的Tricine－SDS－PAGE電泳分析

不同的蛋白酶由于酶切作用方式及酶切位點(diǎn)的不同，導(dǎo)致所得酶解產(chǎn)物的營養(yǎng)成分組成包括肽段的分子質(zhì)量大小和游離氨基酸的組成都有很大的差異，直接影響產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味的好壞［13］。本試驗(yàn)采用 Alcalase、胰蛋白酶、Protamex、Flavourzyme、Protex.7L、木瓜蛋白酶等6種蛋白酶對(duì)大豆蛋白進(jìn)行酶解，并用改進(jìn)的Tricine－SDS－PAGE電泳對(duì)各蛋白酶酶解物進(jìn)行分離，結(jié)果見圖5。從圖5中可以清晰直觀地看出各蛋白酶酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，胰蛋白酶和Flavourzyme酶解產(chǎn)物以分子質(zhì)量大于17 ku的片段為主;Protamex與Protex.7L的酶解情況相似，酶解產(chǎn)物主要以26～17 ku的片段為主;木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物以分子質(zhì)量小于10 ku的肽段為最多;Alcalase酶解產(chǎn)物均勻分布在26～4.6 ku之間。從蛋白質(zhì)分離的效果來看，本試驗(yàn)所獲得Tricine－SDS－PAGE電泳圖譜背景淺、分辨率高，蛋白條帶清晰，但Alcalase以外的其他蛋白酶酶解產(chǎn)物也出現(xiàn)豎向條紋、拖尾、蛋白帶偏斜等問題，這需要進(jìn)一步根據(jù)具體蛋白酶酶解產(chǎn)物的特性，對(duì)電泳條件稍加優(yōu)化。

圖5 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的Tricine－SDS－PAGE圖譜分析

3 討論

隨著多肽生物活性和功能特性的發(fā)現(xiàn)，使得小分子多肽的分離、純化和鑒定變得越來越重要。Tricine－SDS－PAGE與其他分離技術(shù)相比，其所需儀器簡單、操作方便、重現(xiàn)性好、經(jīng)濟(jì)、時(shí)間短，能為小分子蛋白質(zhì)、多肽的研究提供極大方便［14－15］。但分離效果與凝膠濃度、凝膠體系、緩沖液濃度、上樣量以及染色方法等諸多因素密切相關(guān)。本試驗(yàn)在前人的研究基礎(chǔ)上，對(duì)影響大豆多肽分離的主要電泳條件進(jìn)行摸索，建立了較理想的大豆蛋白酶解肽Tricine－SDS－PAGE分離技術(shù)。前人研究顯示，甘油或尿素能增大丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)度，改善小分子的分離效果［6，16］。試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在分離膠中加入30%的乙二醇比加入甘油或尿素更有利于小分子大豆肽的分離，帶型更清晰。大豆小分子肽密度較小，不易下沉，容易擴(kuò)散，當(dāng)上樣緩沖液中甘油含量少于30%時(shí)，帶型成皺眉現(xiàn)象(圖1)，因此在后續(xù)的研究中選擇含30%甘油的上樣緩沖液。對(duì)于酶解產(chǎn)物分離來說，上樣量至關(guān)重要，偏低造成低豐度蛋白難以在膠上呈現(xiàn)，偏高又容易出現(xiàn)過飽和現(xiàn)象。經(jīng)過反復(fù)嘗試，20 μg的上樣量是比較合適的，上樣量僅增加10 μg，就會(huì)出現(xiàn)濃縮不完全，條帶模糊等現(xiàn)象。由于小分子多肽對(duì)染料的結(jié)合力較弱，因此選擇合適的染色方法是必要的。通過比較研究，考馬斯亮藍(lán)G－250染色方法比考馬斯亮藍(lán)R－250更有利于小分子多肽的顯色，這與Westermeier［17］的研究一致，而與姚瑤［18］建立的低分子多肽電泳體系X－尿素－PAGE體系結(jié)論不一致，這可能與其在分離膠中添加新的陰離子表面活性劑X有關(guān)。此外，本試驗(yàn)通過先固定后染色，并在染色和脫色過程中使用60℃水浴，以加快染色和脫色的過程［19］。這一方面可以提高染料與小肽的結(jié)合并減少小肽擴(kuò)散丟失;另一方面可以避免凝膠長時(shí)間浸泡導(dǎo)致凝膠腫脹變形，蛋白帶扭曲變形。

4 結(jié)論

從多肽的分離效果來看，改進(jìn)的Tricine－SDSPAGE系統(tǒng):分離膠凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%、交聯(lián)度為5%并加入30%(體積分?jǐn)?shù))乙二醇，上樣緩沖液含30%甘油，上樣量為20 μg，染色方法采用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法，能顯著提高大豆低分子多肽電泳的分辨率。同時(shí)通過改進(jìn)的Tricine－SDS－PAGE電泳技術(shù)能夠獲得較高分辨率的大豆蛋白不同蛋白酶酶解肽電泳圖譜。大豆蛋白經(jīng)蛋白酶水解后，產(chǎn)生許多分子鏈長度不等的多肽。不同功能性，生理活性肽分布于不同分子質(zhì)量段，并且肽段的分子質(zhì)量大小和氨基酸組成會(huì)直接影響蛋白水解物的營養(yǎng)價(jià)值。本試驗(yàn)建立的大豆蛋白酶解肽Tricine－SDS－PAGE體系能快速、精確、直觀的檢測酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，可以為評(píng)價(jià)大豆蛋白酶解產(chǎn)物的營養(yǎng)價(jià)值以及提高大豆蛋白的生物催化技術(shù)水平提供參考依據(jù)。

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