吳繼美 吳清楠 李任強

(暨南大學生物工程學系，廣州 510632)

膽固醇是血脂的成分之一，參與形成細胞膜，是合成膽汁酸，維生素D以及甾體激素的原料［1］，為人及動物細胞不可缺少的重要物質(zhì)。但高膽固醇被認為可引起冠心病等疾病。膽酸鹽是膽固醇分解后的產(chǎn)物，吸附膽酸鹽并將其排出體外可降低膽酸鹽在肝腸循環(huán)中的積累，從而促進膽固醇降解代謝，達到降膽固醇、降血脂的目的，所以能吸附膽酸鹽的物質(zhì)有利于降血脂。許多研究已證明食物中的一些物質(zhì)能與膽酸鹽結(jié)合，其中蛋白質(zhì)也是能與膽酸鹽結(jié)合的物質(zhì)之一。如Yoshie－Stark等［2］對羽扇豆蛋白及其水解產(chǎn)物在體外結(jié)合膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的能力進行測定，顯示酸溶性蛋白的結(jié)合能力最強;Barbana等［3］研究了扁豆面粉，扁豆?jié)饪s蛋白和小扁豆蛋白水解物在體外與膽酸鹽的結(jié)合，顯示除了脫氧膽酸鈉，對其他膽酸鹽的結(jié)合，小扁豆蛋白水解之后的產(chǎn)物結(jié)合膽酸鹽的能力最強。Kayashita等［4］通過動物試驗發(fā)現(xiàn)蕎麥蛋白提取物能增加小鼠排泄物中中性甾醇的含量，認為蕎麥蛋白具有降低膽固醇的能力。周小理等［5］通過體外吸附膽酸鹽能力的測定證實所提取分離得到的苦蕎水溶性蛋白具有一定的降血脂功能。Kongo－Dia－Moukala等［6］研究經(jīng)過5種不同蛋白酶消化的脫脂玉米蛋白水解產(chǎn)物與甘氨膽酸鈉、膽酸鈉和脫氧膽酸鈉的結(jié)合能力，結(jié)果顯示脫脂玉米蛋白經(jīng)過不同的蛋白酶消化后與膽酸鹽的結(jié)合能力不同，但結(jié)合能力最強的大部分肽的分子質(zhì)量為180～500 u。Kahlon等［7］研究體外膽汁酸結(jié)合米糠、燕麥麩、脫殼大麥和β－葡聚糖富氧大麥的能力發(fā)現(xiàn)，在相同蛋白物質(zhì)的基礎(chǔ)上，米糠和去殼大麥吸收量相對較高。

稻谷、小麥、大豆、玉米、馬鈴薯和甘薯等是人類的主要糧食，關(guān)于它們組成的一些成分的降血脂功效已有較多報道，但針對這些糧食水溶性蛋白與膽汁酸(鹽)結(jié)合能力的研究報道甚少。所以，本研究的目的是提取這些糧食的水溶性蛋白，分析它們的組成特點及其在體外與膽酸鹽結(jié)合的能力，以期了解這些糧食的保健價值等。研究對于更深入的了解這些主要糧食的特性及其與飲食健康之間的關(guān)系有很好的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑、儀器

1.1.1 糧食原料

甘薯:廣薯155，廣東，2012年產(chǎn);玉米:粵甜13號，廣東，2012年產(chǎn);稻谷:秈米，廣東，2012年產(chǎn);大豆:普通黃豆，吉林，2012年產(chǎn);馬鈴薯:魯引1號，山東，2012年產(chǎn);小麥:濟麥22，山東，2012年產(chǎn)。

1.1.2 主要試劑

Sephadex－G75:Pharmacia公司;膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛黃膽酸鈉和牛血清白蛋白:美國Sigma公司;硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、石油醚等均為分析純。

1.1.3 主要儀器

Gold spectrumlab54紫外可見分光光度計:上海棱光技術(shù)有限公司;DS－1高速組織搗碎機:上海標本模型廠;Thermo BR4i高速冷凍離心機:Thermo公司;Scientz－10N冷凍干燥機:寧波新芝生物科技股份有限公司;MALAYSIA漩渦振蕩器:電熱恒溫水浴鍋:上海悅豐儀器有限公司;電泳儀:BIO－RAD;FR－980生物電泳圖像分析系統(tǒng):上海復(fù)日科技公司;Delta 320型精密pH計:梅特勒－托利多上海公司。

1.2 方法

1.2.1 水溶性蛋白的提取［8］

分別取適量的大豆、大米、玉米、小麥干粉，加約2倍(V/m)石油醚在4℃下攪拌1 h脫脂，4 000 r/min離心30 min去上清液。樣品風干后用約4倍(V/m)蒸餾水在4℃下攪拌2 h，離心取上清液，加95%飽和度的硫酸銨進行鹽析，靜置0.5 h后離心去上清液，蒸餾水溶解沉淀，用蒸餾水透析得水溶性蛋白樣品。新鮮的馬鈴薯和甘薯清洗干凈，稱量切成小塊加少量蒸餾水置于組織搗碎勻漿機中勻漿，離心取上清液，加95%飽和度的硫酸銨進行鹽析，靜置0.5 h后離心去上清液，蒸餾水溶解沉淀，用蒸餾水透析得水溶性蛋白樣品。

1.2.2 水溶性蛋白提取液的蛋白含量測定［9－10］

采用紫外(UV)吸收法［9－10］測定各樣品蛋白質(zhì)含量。分別取牛血清白蛋白標準溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 定容于 10 mL 容量瓶中，用紫外可見分光光度計測定280 nm處吸光度。以牛血清白蛋白濃度為橫坐標，溶液吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得出標準直線方程。測定各糧食蛋白樣品在280 nm處吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算樣品蛋白質(zhì)含量。按公式:計算蛋白提取率。式中:Q為提取率/%;c為提取液濃度/mg/mL;V為提取液體積/mL;m為樣品初始質(zhì)量/g。

1.2.3 樣品蛋白的電泳鑒定［11］

使用還原性十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)進行電泳鑒定各樣品的蛋白。電泳分離膠體積分數(shù)為12%，濃縮膠體積分數(shù)為5%。利用電泳系統(tǒng)對電泳結(jié)果進行密度掃描等分析。

1.2.4 樣品吸附膽酸鹽能力的測定

首先參照文獻［12］方法略作修改進行膽酸鹽含量標準曲線的測定。以0.1 mol/L、pH 6.3的磷酸緩沖液分別配置0.9 mmol/L的膽酸鈉(SC)、脫氧膽酸鈉(SDC)和牛磺膽酸鈉(STC)的標準液。分別取上述標液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，加入 0.1 mol/L、pH 6.3的磷酸緩沖液至2.5 mL，然后加入7.5 mL質(zhì)量分數(shù)為60%的硫酸溶液，于70℃水浴20 min，冷卻后分別對同濃度的SC、SDC和STC樣品進行全波長掃描確定最大光吸收值時的波長都為377 nm，所以測定各樣品在377 nm波長處的吸光度繪制標準曲線，得出各膽酸鹽含量標準直線方程。

參照文獻［10］和［12］方法略作修改測定樣品蛋白結(jié)合膽酸鹽的能力。分別取各樣品水溶性蛋白液1 mL于10 mL具塞試管中，加入1 mL 0.01 mol/L的HCl，在37℃恒溫振蕩消化1 h，以0.1 mol/L的NaOH調(diào)pH 6.3，每個樣品中分別加入4 mL膽酸鹽標準液(依次測定SC、SDC和STC)，在37℃恒溫振蕩1 h后轉(zhuǎn)入離心管，以10 000 r/min離心10 min，上清液為分析液。分別取分析樣液2.5 mL于10 mL具塞試管中，加入7.5 mL質(zhì)量分數(shù)60%的硫酸，于70℃水浴20 min，取出冷卻，測定在377 nm處的吸光值，由標準曲線求得樣液中膽酸鹽的濃度。以所加入膽酸鹽的濃度減去此濃度即為被蛋白結(jié)合了的膽酸鹽的濃度，計算單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)結(jié)合膽酸鹽的能力。每個樣品的測定做多次重復(fù)，進行數(shù)理統(tǒng)計。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2007制作標準曲線以及折線圖。水溶性蛋白含量測定以及蛋白質(zhì)提取率重復(fù)3次;膽酸鹽吸附測定重復(fù)4次;對結(jié)果均以平均值±標準差(±s)表示。采用spss16.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對膽酸鹽結(jié)合量進行方差分析;各組間比較采用One－Way ANOVA單因素方差分析。P＜0.05為差異顯著、P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶性蛋白的提取和鑒定

蛋白質(zhì)含量測定的牛血清白蛋白標準曲線的相關(guān)系數(shù) R2=0.998 7，直線方程為 y=0.456 2x+0.000 1。根據(jù)直線方程計算6種糧食提取液的水溶性蛋白質(zhì)濃度，按照1.2.2中的公式計算提取率的結(jié)果列于表1。從表1可見，大豆的水溶性蛋白含量最高，濟麥22品種的小麥次之，而魯引1號品種的馬鈴薯相對較低。

表1 各樣品水溶性蛋白的濃度及提取率(±s，n=3)

表1 各樣品水溶性蛋白的濃度及提取率(±s，n=3)

注:﹡大豆、玉米、大米和小麥的提取率以干粉計算，馬鈴薯和甘薯的提取率以濕重計算

樣品 大豆 玉米 大米 小麥 馬鈴薯 甘薯質(zhì)量濃度/mg/mL 8.51 ±0.020 7.34 ±0.010 8.18 ±0.017 8.37 ±0.023 8.56 ±0.019 8.45 ±0.031﹡提取率 g/100 g 7.92 ±0.320 1.12 ±0.021 1.37 ±0.017 3.34 ±0.016 0.13 ±0.021 2.10 ±0.036

對各樣品水溶性蛋白進行SDS－PAGE結(jié)果如圖1(5次電泳，取質(zhì)量最好的電泳圖標出)。對電泳圖蛋白進行密度和條帶掃描分析，得到表2。從圖1可以看出，各樣品的蛋白組成差異較大，秈米、大豆、和濟麥22品種的小麥的蛋白種類較多，廣薯155品種的甘薯的蛋白種類最少。明顯的，相對分子質(zhì)量小于44.3的蛋白是構(gòu)成6種糧食水溶性蛋白的主要成分，而其中相對分子質(zhì)量小于29 ku的部分占的比例較高，特別是廣薯155品種的甘薯，相對分子質(zhì)量小于29的蛋白占的比例高達94.7%。

圖1 6種糧食水溶性蛋白SDS－PAGE圖譜

表2 6種糧食水溶性蛋白條帶數(shù)及按分子量質(zhì)大小的組成的質(zhì)量分數(shù)/%(n=5)

2.2 水溶性蛋白與膽酸鹽結(jié)合的能力

由于廣薯155品種的甘薯水溶性蛋白組成成分較簡單，大小相對分子質(zhì)量的蛋白相差大，所以通過Sephadex－G75分子篩處理得出相對分子質(zhì)量較小部分的蛋白如圖2。此蛋白和6種糧食水溶性蛋白一起測定它們與膽酸鹽的結(jié)合能力。

膽酸鹽含量標準曲線的測定得出:膽酸鈉的直線方程為 y=0.911 6x－0.029 3，相關(guān)系數(shù) R2=0.992 8;脫氧膽酸鈉的直線方程為 y=0.808 9x－0.028 1，相關(guān)系數(shù) R2=0.986 5;牛黃膽酸鈉的直線方程為 y=0.331 1x －0.014 2，相關(guān)系數(shù) R2=0.993 1。都具有良好線性，符合要求。6種糧食樣品水溶性蛋白及廣薯155品種的甘薯相對分子質(zhì)量較小蛋白對膽酸鹽的結(jié)合能力測定結(jié)果列于表3。

圖2 廣薯155品種的甘薯相對分子質(zhì)量較小部分的蛋白SDS－PAGE圖譜

表3 6種糧食水溶性蛋白及甘薯低相對分子質(zhì)量蛋白對各種膽酸鹽的結(jié)合能力(n=4)

根據(jù)表3按結(jié)合能力大小順序作出6種糧食水溶性蛋白與3種膽酸鹽結(jié)合的折線圖，如圖3。

圖3 6種糧食水溶性蛋白吸附膽酸鹽能力比較

圖3橫坐標表示6個糧食品種，縱坐標表示6種糧食水溶性蛋白的膽酸鹽結(jié)合量?？梢姡?種糧食水溶性蛋白對膽酸鈉、脫氧膽酸鈉和?；悄懰徕c都有吸附能力，但對膽酸鈉、脫氧膽酸鈉的吸附力相對較好，而對?；悄懰徕c的吸附力較弱，這與前人的研究結(jié)果相吻合，因為?；悄懰徕c是一類較難被吸附的結(jié)合型膽酸鹽［13］。在6種糧食中，濟麥22品種的小麥水溶性蛋白對膽酸鈉、脫氧膽酸鈉和牛磺膽酸鈉這3種膽酸鹽都表現(xiàn)出最大吸收量，與其他5種糧食相比具有極顯著差異(P＜0.001)，為高質(zhì)量的蛋白。由數(shù)理統(tǒng)計分析得出:相同單位重量的蛋白對膽酸鈉的吸附能力是，小麥＞玉米＞大米＞大豆＞馬鈴薯＞甘薯，其中，濟麥22品種的小麥吸附能力顯著性高于其他樣品，秈米和大豆、秈米和粵甜13號品種的玉米之間吸附能力無顯著性差異，但這三者與魯引1號品種的馬鈴薯、廣薯155品種的甘薯之間有顯著性差異，魯引1號品種的馬鈴薯和廣薯155品種的甘薯之間吸附力也有顯著性差異。吸附脫氧膽酸鈉的能力是，小麥＞大米＞玉米＞大豆＞馬鈴薯＞甘薯，各樣品水溶性蛋白吸附力之間有顯著性差別。吸附?；悄懰徕c的能力是，小麥＞大米＞大豆＞玉米＞馬鈴薯＞甘薯，除了魯引1號品種的馬鈴薯與廣薯155品種的甘薯之間外，各樣品之間的吸附力都有顯著性差異。以總的對3種膽酸鹽吸附能力進行比較，小麥＞大米＞玉米＞大豆＞馬鈴薯＞甘薯，濟麥22品種的小麥最好，極顯著性高于其他糧食，但秈米和粵甜13號品種的玉米之間、粵甜13號品種的玉米和大豆之間的吸附力無顯著性差異，而魯引1號品種的馬鈴薯、廣薯155品種的甘薯則顯著性低于其他樣品。

分析各糧食水溶性蛋白組成的特點與它們吸附膽酸鹽能力之間的關(guān)系可以看出，蛋白的組成種類與吸附力相關(guān)，不同的蛋白組成種類使各樣品表現(xiàn)出不同的吸附力，魯引1號品種的馬鈴薯和廣薯155品種的甘薯水溶性蛋白種類較少，吸附膽酸鹽的能力也較小。

吸附膽酸鹽能力較強的濟麥22品種的小麥、秈米、粵甜13號品種的玉米和大豆等4種糧食的水溶性蛋白組成的特點是不僅種類多，而且小相對分子質(zhì)量的蛋白占的比例較大。小于44.3相分子質(zhì)量的蛋白在組成上占了絕大部分(表2)。廣薯155品種的甘薯小分子質(zhì)量蛋白對3種膽酸鹽的吸附能力都大于廣薯155品種的甘薯總的水溶性蛋白(表3)，這可能說明，總的來說小相對分子質(zhì)量水溶性蛋白吸附膽酸鹽的能力更好。膽酸和脫氧膽酸約占人體總膽酸鹽的30%和20%，且在人體內(nèi)一般以鈉鹽的形式存在，而牛磺膽酸鈉是一類較難被吸附的結(jié)合型膽酸鹽［13］。水溶性蛋白對膽酸鈉和脫氧膽酸鈉的吸附力明顯的高于對?；悄懰徕c的吸附力，既因為?；悄懰徕c是一類較難被吸附的結(jié)合型膽酸鹽外，又可能由于膽酸鈉和脫氧膽酸鈉分子中含有羥基能更有效地與水溶性蛋白的羥基和氨基以氫鍵形式相互作用，從而達到更穩(wěn)定高效的吸附效果［13－14］。

在烹飪或加工過程中，糧食的水溶性蛋白較易損失。本研究結(jié)果可加深對這些主要糧食的水溶性蛋白價值的認識，為合理進行這些糧食的處理、提高它們的價值和開發(fā)利用糧食水溶性蛋白提供了有意義的數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

通過分析稻谷、小麥、大豆、玉米、馬鈴薯和甘薯等6種主要糧食水溶性蛋白的組成特點和提取率，說明了大豆水溶性蛋白含量最高，小麥次之，馬鈴薯最低;稻谷、大豆和小麥的水溶性蛋白組成種類多，而馬鈴薯和甘薯則組成種類少。測定這些蛋白樣品在體外生理pH 6.3條件下與膽酸鹽結(jié)合的能力和進行數(shù)理統(tǒng)計，證明了這6種糧食水溶性蛋白對膽酸鈉、脫氧膽酸鈉具有較好的吸附作用，對?；悄懰徕c吸附作用較弱。相同蛋白質(zhì)量情況下，小麥水溶性蛋白吸附膽酸鹽的能力最強，極顯著性地大于其他5種糧食;稻谷和玉米之間、玉米和大豆之間的吸附力無顯著性差異，而馬鈴薯、甘薯則顯著性低于其他樣品。這些糧食水溶性蛋白吸附膽酸鹽能力的差異主要與蛋白組成有關(guān)，蛋白種類少吸附能力也小，低相對分子質(zhì)量水溶性蛋白對膽酸鹽的結(jié)合能力可能比高相對分子質(zhì)量的水溶性蛋白要強。

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