孫 蓮， 嚴 雷， 勉強輝， 孟海強

(1．新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊830011;2．烏魯木齊市防疫站，新疆 烏魯木齊830011)

藥桑是新疆獨有的桑品種之一，是我國國內(nèi)唯一的具有22倍體花性染色體的桑品種，是新疆目前桑品種分類鑒定中唯一的黑桑種，藥用價值極高［1］?，F(xiàn)代藥理研究證明，桑葉具有降血糖、降血壓、抗菌和抗病毒等多種藥理活性，能預(yù)防和治療糖尿病。黃酮類成分為桑葉的主要功效成分，桑葉黃酮主要為蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素等，桑葉黃酮具有很好的降血糖、降血脂、抗氧化和抗菌等作用［2-11］，分析測定桑葉中黃酮類成分對開發(fā)利用新疆的桑葉資源具有重要意義。本實驗采用HPLC法對新疆藥桑葉中的綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇及槲皮素進行同時測定［12-15］。為新疆藥桑葉的質(zhì)量控制提供了理論與數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀 (LC—20，日本島津公司)。

1.2 試藥 綠原酸 (中國藥品生物制品檢定所，批號100080-200707)，蘆丁對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號0080-9504)，槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號081-9003)，異槲皮苷對照品 (上海晶純醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號27988)，紫云英苷對照品 (上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號 MUST-11092001)，白藜蘆醇 (Sigma公司，純度99%，100 mg/瓶)，乙腈、磷酸為色譜純;甲醇等均為分析純。藥桑葉采自新疆喀什 (5、6、7、8、9、10月份)及和田，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為桑科植物藥桑的葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱溫40℃;流動相A為0.2% 的磷酸水溶液，B為0.2% 磷酸乙腈溶液，梯度洗脫，0 min，15%B;9 min，20%B，20 min，25%B，30 min，35%B;40 min，40%B。檢測波長 360 nm，體積流量0.6 mL/min，進樣量20μL。按照上述色譜條件下6種成分的色譜圖見圖1。

圖1 對照品 (A)與樣品 (B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances(A)and sample(B)

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取綠原酸5.30 mg、蘆丁5.30 mg、異槲皮苷5.20 mg、紫云英苷5.30 mg、白藜蘆醇5.40 mg、槲皮素5.50 mg置于5 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇及槲皮素分別為 1.06、1.06、1.04、1.06、1.08、1.10 mg/mL的對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取不同產(chǎn)地不同月份的藥桑葉粉末 (過60目篩)5.000 g，置于100 mL三角瓶中，加入甲醇40 mL，超聲提取30 min，過濾，濾渣再用40 mL甲醇超聲提取30 min，合并濾液，濃縮后，用甲醇定容于5 mL的量瓶中，用時過0.22μm微孔濾膜。

2.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取上述綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇及槲皮素對照品溶液適量，用甲醇配成對照品混合液，分別精密吸取對照品混合液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5.0 mL的量瓶中，用甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分別進樣 20μL，以峰面積為縱坐標，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見表1。

2.4 精密度試驗 精密吸取上述綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇、槲皮素對照品貯備液各200μL，混勻，連續(xù)進樣6次，進樣量20 μL，求得綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素峰面積的RSD(n=6)分別為1.2%、1.8%、2.8%、0.90%、1.9%及1.3%。

表1 6種成分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of six components

2.5 重復(fù)性試驗 按2.2.2項下供試品溶液制備方法，平行制備5份喀什地區(qū)6月份藥桑葉溶液，在上述色譜條件下進行測定，記錄峰面積，計算樣品中各成分的量。得綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇及槲皮素的RSD分別為1.6%、1.0%、1.8%、2.4%、0.80%、2.6%，表明該實驗的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 按2.2.2項下制備喀什地區(qū)8月份藥桑葉供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12、24 h進樣20μL，記錄峰面積，計算樣品中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇及槲皮素量的 RSD分別為 1.6%、1.8%、2.6%、1.8%、0.60%、1.4%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率 精密稱取已知綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇及槲皮素量的喀什地區(qū)6月份藥桑葉粉1.000 0 g，置于100 mL三角瓶中，共6份，于每份中加入綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇及槲皮素對照品溶液適量，按2.2.2項下制備供試品溶液，進樣20μL，計算各對照品的平均加樣回收率和RSD，見表2。

表2 加樣回收率 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

2.8 樣品測定 由保留時間及在樣品中加標峰增高法定性可知，新疆藥桑葉中含有綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇及槲皮素。精密稱取不同產(chǎn)地不同月份的藥桑葉樣品5.000 0 g，各5份，按2.2.2項制備供試溶液，在上述色譜條件下，分別進樣20μL。記錄峰面積，代入回歸方程計算得藥桑葉中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇及槲皮素量，結(jié)果見表3。

由以上測定結(jié)果可知，藥桑葉中綠原酸的量較高，嫩桑葉中綠原酸的量最高，隨著桑葉的逐漸成熟，量逐漸降低。藥桑葉的黃酮類成分中蘆丁和異槲皮苷的量較高，紫云英苷和槲皮素的量中等，白藜蘆醇的量較少。蘆丁和紫云英苷的量隨著桑葉的逐漸成熟，逐漸升高，到10月份時，含有量有所降低;異槲皮苷、白藜蘆醇及槲皮素的量隨月份的不同變化無規(guī)律。

表3 樣品測定結(jié)果 (n=5)Tab.3 Results of contents determination of samples(n=5)

3 討論

3.1 流動相的選擇 分別以乙腈-0.01 mol/L醋酸銨水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液、0.2%磷酸水溶液-0.2%磷酸乙腈溶液為流動相。發(fā)現(xiàn)選擇乙腈-0.01 mol/L醋酸銨水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液及甲醇-0.4%磷酸水溶液為流動相，在不同的梯度時，蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷都無法達到基線分離，選用0.2%磷酸水溶液-0.2%磷酸乙腈溶液為流動相時，梯度洗脫，6種成分均達到了基線分離，同時梯度洗脫中隨著0.2%磷酸乙腈溶液比例的增加，色譜峰的對稱性增強，峰的拖尾現(xiàn)象減少了。故本實驗選擇0.2%磷酸水溶液-0.2%磷酸乙腈溶液為流動相，梯度洗脫。

3.2 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器，對6種對照品溶液進行了200～400 nm紫外掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、白藜蘆醇、槲皮素的λmax分別為 254、355 nm、254、360 nm、254、360 nm、260、355 nm、260、360 nm、265、366 nm。對樣品溶液分別在254、260、265、355、360、366 nm波長下的色譜峰進行比較，發(fā)現(xiàn)在檢測波長為360 nm時，6種成分均有最大吸收，且峰形較好，基線平穩(wěn)，分離度較高，故將檢測波長定為360 nm。

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