孟利娜， 于 敬， 許 靜， 南 楠， 周 晶

(天津醫(yī)科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070)

北蒼術為菊科植物北蒼術Atractylodes chinensis(DC．)Koidz．的干燥根莖［1］，為《中國藥典》2010年版收載的蒼術藥材之一。其性味辛、苦、溫，歸脾、胃經，具有健脾、燥濕、解郁、辟穢之功效［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒼術揮發(fā)油具有抗?jié)?、抗心率失常、降血壓、利尿、保肝、抗菌等作用?］。因此，簡便而有效的獲取蒼術揮發(fā)油對充分利用蒼術藥材具有重要的實用價值。

目前蒼術揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣蒸餾法［4］，超臨界 CO2萃取法［5］，同時蒸餾萃取法［6］，頂空固相微萃取法［7］等。上述方法中有的揮發(fā)油提取率較低，有的需要特定的設備，目前實施于生產中仍有一定的局限性。本實驗采用酶法處理藥材，結合直接蒸餾法提取北蒼術揮發(fā)油，并通過正交實驗優(yōu)化得到最佳的酶解提取工藝，該條件下，不需要特殊的儀器設備即可以顯著地提高蒼術油的提取率。為生產中充分利用蒼術藥材資源及工業(yè)化生產推廣提供了理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 (安捷倫公司7890A-5975C型)，Agilent 190915-433 HP-5色譜柱:(30 m ×250 μm ×0.25μm);84-1磁力攪拌控溫電熱套 (華魯電熱公司);電子分析天平 (FA2004N)，PHS-25型精密酸度計(杭州亞美電子儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋 (北京科偉永鑫實驗儀器設備廠)。

1.2 材料 酶 (活力單位5000 U/g)購自天津利華酶制品廠 (批號:11-08-30);北蒼術 (河北安國市同利中藥材有限公司提供，由天津醫(yī)科大學生藥教研室周曄教授鑒定)，符合《中國藥典》2010版 (一部)要求;檸檬酸、檸檬酸鈉、無水乙醚 (分析純，天津基準化學試劑有限公司);無水硫酸鈉 (化學純，天津市塘沽鄧中化工廠);正己烷 (色譜純，天津康科德試劑公司)。

2 方法與結果

2.1 水蒸氣蒸餾法提取 精密稱取40目北蒼術50 g，置于1 000 m L的圓底燒瓶中，加入12倍量蒸餾水，按《中國藥典》2010年版［1］項下的揮發(fā)油提取法提取4 h，所得揮發(fā)油經乙醚萃取，無水硫酸鈉脫水，吸取乙醚溶液，揮干乙醚，得氣味芳香的棕紅色油狀物，精密稱取揮發(fā)油質量。

2.2 酶法輔助提取蒼術油的單因素條件篩選

2.2.1 酶種類的選擇 精密稱取40目北蒼術50 g，分別加入藥材質量1.0%的纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶，各溶于12倍量 pH4.5的檸檬酸緩沖液中，40℃條件下酶解1 h后，按照《中國藥典》(2010版)項下的揮發(fā)油提取法提取4 h，以下操作同2.1項下，結果顯示，由半纖維素酶處理的藥材，其揮發(fā)油的提取量最高，因此選用半纖維素酶進行下列酶解工藝的條件篩選。

2.2.2 酶用量對揮發(fā)油產率的影響 精密稱取40目北蒼術50 g，依據(jù)2.2.1項結果，分別加入相當于藥材質量的0、0.5%、1%、1.5%、2.0%、3.0% 的半纖維素酶，各溶于12倍量pH4.5的檸檬酸緩沖液中，40℃條件下酶解1 h后，以下操作同2.1項下，結果如圖1所示。當酶用量小于1%時，隨著酶用量的增加，揮發(fā)油產率升高，當酶用量達到1%后，產率稍有下降且趨于平穩(wěn)，以酶用量為藥材質量1%較好。

圖1 酶用量對揮發(fā)油提取量的影響

2.2.3 酶解時間對揮發(fā)油產率的影響 精密稱取40目北蒼術50 g，依據(jù)2.2.2項結果，加入藥材質量1%的半纖維素酶，以下操作同2.1項下，分別酶解0、0.5、1.0、1.5、2.0、3 h，結果見圖2，隨著酶解時間的延長，揮發(fā)油產率也有所提高，當酶解時間為1 h，揮發(fā)油產率最高，隨后揮發(fā)油產率逐漸下降。

2.2.4 酶解pH值對揮發(fā)油產率的影響 精密稱取40目北蒼術50 g，加入藥材質量1%的半纖維素酶，以下操作同2.1 項下，分別在pH3.0、4.0、4.5、5.0、5.5時酶解1 h，結果如圖3所示。在pH4.5時，揮發(fā)油產率最高。pH過低或過高時揮發(fā)油產率都有所降低。

圖2 酶解時間對揮發(fā)油提取量的影響

圖3 不同pH對揮發(fā)油提取量的影響

2.2.5 酶解溫度對揮發(fā)油產率的影響 精密稱取40目北蒼術50 g，加入藥材質量1%的半纖維素酶，以下操作同2.1項下，分別在35、40、45、50、55℃條件下酶解1 h。不同酶解溫度對揮發(fā)油產率的影響如圖4所示。結果顯示，45℃時揮發(fā)油產率最高，而溫度過高或過低時產率都有所下降，其原因可能是溫度過高使酶失活，溫度過低又不能充分發(fā)揮酶的活性。

圖4 不同溫度對揮發(fā)油提取量的影響

2.3 正交設計優(yōu)選工藝條件

2.3.1 正交試驗設計 根據(jù)單因素初步實驗結果，選取酶的用量、酶解時間、酶解溫度以及酶解pH四因素，每個因素設計3個水平，見表1。

表1 L 9(34)正交試驗因素水平

2.3.2 正交試驗結果及方差分析 精密稱取40目北蒼術50 g，分別按L9(34)正交設計表設定的條件進行酶解后，按照《中國藥典》2010年版揮發(fā)油項下提取揮發(fā)油，以下操作同2.1項下，以揮發(fā)油提取量為指標，結果見表2。方差分析結果見表3。

表2 正交試驗方案與結果

表3 方差分析

從表2直觀分析，各因素對北蒼術揮發(fā)油提取率的影響程度大小為D(酶解溫度) ＞C(酶解pH)＞A(酶用量)＞B(酶解時間)，初步認為工藝條件最佳組合為A2B3C2D2。方差分析結果表明，其中酶解溫度對揮發(fā)油提取量具顯著性影響 (P＜0.05)，A、B、C的影響均無顯著性 (P＞0.05)。綜合分析上述結果，確定最佳提取工藝條件是:酶用量為藥材的1.0%，在pH4.5，45℃條件下酶解1.0 h。

2.3.3 驗證試驗 精密稱取40目北蒼術50g，按優(yōu)選工藝條件進行重復驗證試驗，同時做對照試驗，由表4可知，酶解-蒸餾法揮發(fā)油提取量比直接蒸餾法提高20.82%，且重現(xiàn)性好。

表4 驗證試驗結果

2.4 北蒼術揮發(fā)油成分測定

2.4.1 氣相色譜-質譜測定條件

氣相色譜條件:HP-5彈性石英毛細管柱 (30 m ×250 mm ×0.25μm)，初始溫度60℃;程序以6℃/min升溫至260℃;氣化室溫度260℃;進樣量1.00μL;分流比10∶1;溶劑延遲3 min，載氣為高純氦氣。

質譜條件:MS-EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描范圍30～500 u;G1036A NIST2008版標準圖庫。

2.4.2 定性分析 分別取2.3.3項下直接蒸餾法和酶解輔助蒸餾法提取的揮發(fā)油適量，用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀分析鑒定。通過ChemStation工作站檢索NIST譜圖庫，再結合有關文獻進行人工圖譜解析，確認其化學成分。兩種方法提取揮發(fā)油中各主要組分的相對百分含量見表5。蒸餾法、酶解-蒸餾法提取北蒼術揮發(fā)油的氣相色譜圖見圖5、圖6。

表5 酶解輔助提取法和SD法提取北蒼術揮發(fā)油的化學成分及其相對質量分數(shù)

圖5 直接蒸餾法提取北蒼術揮發(fā)油GC圖

圖6 酶解輔助提取北蒼術揮發(fā)油GC圖

圖5和圖6表明，蒸餾法和酶解輔助蒸餾法提取的北蒼術揮發(fā)油氣相色譜圖整體相同，各物質的保留時間主要集中在9～15 min。由表5可知揮發(fā)油的主要成分為蒼術素、蒼術酮、β-桉葉醇和B-香葉烯，酶解后蒼術酮和β-桉葉醇的百分含量明顯提高。

3 討論

2010 年版《中國藥典》中揮發(fā)油的測定采用直接蒸餾法，本研究采用酶解-蒸餾法提取蒼術油，其蒼術油的質量分數(shù)較《中國藥典》2010年版法提高了20.82%。這是因為植物細胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質等物質構成的致密結構，選用適當?shù)拿?，在合適的條件下，可以使細胞壁的組織水解，破壞細胞壁的致密構造，減少細胞內成分溶出的屏障，從而有利于有效成分的溶出。由于半纖維素酶是多種酶的復合體，由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶等組成，所以，分解植物細胞壁效果好于單一纖維素酶與果膠酶［8］。酶解輔助提取植物中的活性成分，不僅可以提高有效成分浸出率，且不需要特定的設備，易于實施，成本較低，為北蒼術揮發(fā)油的工業(yè)化生產提供科學依據(jù)和參考。

有研究表明，β-桉葉醇能夠促進胃腸運動［9］，抗缺氧［10］，通過降低重復性刺激引起的乙酰膽堿的再生釋放對抗新斯的明誘導的神經肌肉障礙［11］等;蒼術酮具有細胞毒性，能抑制肝毒細胞對肝組織的破壞作用，修復肝損傷［12］;也有體外實驗證明，蒼術酮在質量濃度為1 mg/mL時對甲型流感病毒H3N2亞型、高致病性禽流感病毒H5N1亞型和乙型流感病毒株均有殺滅作用［13］。本研究通過酶解輔助提取較直接蒸餾法提取蒼術揮發(fā)油，其油中的活性成分蒼術酮和β-桉葉醇的相對質量分數(shù)分別提高32.79%和34.61%，為提高蒼術藥材的臨床應用效果、減小劑量提供借鑒。

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