王 靚， 侯曉燕， 黃金玲， 施 慧

(安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥230038)

急性心肌梗死 (acute myocardial infarction)后缺血性心肌病已經(jīng)成為慢性心力衰竭 (chronic heart failure)最常見的原因之一，急性心肌梗死后心室重構(gòu) (ventricular remodeling)是導(dǎo)致患者臨床癥狀不斷惡化，慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。既往研究顯示［1-2］，益氣溫陽(yáng)、健脾化飲之經(jīng)典名方苓桂術(shù)甘湯能夠顯著抑制急性心肌梗死后6周慢性心力衰竭模型大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌及細(xì)胞因子過度表達(dá)，阻抑心室重構(gòu)，改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，對(duì)急性心肌梗死所致慢性心力衰竭有積極的防治作用。本實(shí)驗(yàn)觀察苓桂術(shù)甘湯對(duì)急性心肌梗死2周后心室重構(gòu)模型大鼠腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)的影響，探討其干預(yù)心室重構(gòu)的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 苓桂術(shù)甘湯 (茯苓12 g、桂枝9 g、白術(shù)9 g、甘草6 g)由亳州興和藥業(yè)有限公司提供，參考文獻(xiàn)［3］提取制成干浸膏粉末 (4.8 g生藥/g，其中桂皮醛9.945 mg/g，甘草酸14.71 mg/g);卡托普利為中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品 (批號(hào):011031)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量0.18～0.22 kg，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(皖)2011-002。

1.3 主要試劑 Trizol Reagent、大鼠TNF-α熒光定量引物及探針均由invitrogen公司設(shè)計(jì)合成，批號(hào):42801、NSO-512728-019;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑和Taq DNA聚合酶均由美國(guó) Fermentas公司生產(chǎn)，批號(hào)為 00097559、00090703、00093869;熒光定量試劑盒由TaKaRa公司生產(chǎn)，批號(hào)BK7203;PVDF膜由美國(guó)millipore公司生產(chǎn)，批號(hào)K1JA0907MK;ECL試劑盒由美國(guó)pierce公司生產(chǎn)，批號(hào)MJ161901;TNF-α大鼠ELISA檢測(cè)劑盒由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20111105248。

1.4 主要儀器 ABI 2720型PCR儀和ABI 7500型RT-PCR儀均由美國(guó)ABI公司生產(chǎn);Bio-pro CN-UV型GSM凝膠圖像分析系統(tǒng)由美國(guó)Sim公司生產(chǎn);Multiskan MK2型酶標(biāo)儀由芬蘭Labsystem公司生產(chǎn);Modulus多功能光度計(jì)由美國(guó)Turner Biosystems公司生產(chǎn);FR-180A型電泳槽由上海復(fù)旦生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究所生產(chǎn);DYY-Ⅱ型電泳儀由北京市六一儀器廠生產(chǎn);5417R型高速低溫離心機(jī)由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn);NABILA 175型－80℃低溫冰箱由日本松下電器公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 急性心肌梗死模型復(fù)制 參考文獻(xiàn) ［4］采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法。取雄性SD大鼠130只，乙醚麻醉后在呼吸機(jī)輔助下，無(wú)菌開胸，用6－0眼科縫合線在距左冠狀動(dòng)脈根3 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，左心室顏色變淺，閉胸。術(shù)后大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)S-T段抬高者視為造模成功，假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎。

2.2 動(dòng)物分組、給藥及方法 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后2周，將模型大鼠隨機(jī)分為5組 (每組12只):模型組，苓桂術(shù)甘湯小、中、大劑量組 (2.1、4.2、8.4 g生藥/kg，按體表面積法計(jì)算相當(dāng)于臨床成人等效量的0.5、1、2倍)，卡托普利組 (4.375 mg/kg，按體表面積法計(jì)算相當(dāng)于臨床成人等效量的1倍)，另設(shè)假手術(shù)組 (10只)。各組大鼠灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組灌胃等容積蒸餾水，灌胃容積為10 mL/kg體質(zhì)量，每日1次，連續(xù)4周。

2.3 觀察指標(biāo)及方法 連續(xù)灌胃處理4周后，各組大鼠腹腔注射烏拉坦5 mL/kg體質(zhì)量麻醉，背位固定，于大鼠腹主動(dòng)脈取血，靜置4 h，低溫3 500 r/min離心10 min，分離血清，－20℃冰箱保存待測(cè)。采血后，無(wú)菌剖取心臟，冰生理鹽水沖洗，剪取左心室心肌組織 (含室間隔)，－80℃冰箱保存待測(cè)。

2.3.1 采用Western blot檢測(cè)大鼠心肌組織TNF-α蛋白取左心室心肌組織50 mg，添加RIPA細(xì)胞裂解液，制備心肌組織勻漿，離心取上清，按1∶4比例加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，冷卻至室溫后，取蛋白樣品上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜 (β-actin蛋白分子量為43 kDa，TNF-α蛋白分子量為17 kDa)，加入Western封閉液室溫封閉2 h，按照說明書一抗孵育2 h，二抗孵育1.5 h，洗膜后使用ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白，結(jié)果采用Quantity one灰度分析軟件進(jìn)行分析。

2.3.2 采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠心肌TNF-αmRNA表達(dá)取左心室心肌組織50 mg，加入1 mol Trizol，分步經(jīng)三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇處理后，抽提總RNA，加入80μL DEPC水，55℃ 10 min使RNA溶解，以actin為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。引物及探針序列如下:actin(上游5’-CGATGCCCTGAGGCTCTTT-3’、下 游 5’-TGGATGCCACAGGATTCCA-3’、探針 5’-CCAGCCTTCCTTCTT-3’)，TNF-α (上 游 5’-CTGGCCAATGGCATGGAT-3’、下 游5’-GGTACAGCCCATCTGCTGGTA-3’、探針 5’-TCAAAGACAACCAACTGGT-3’)。反應(yīng)體系:2×Goldstar Taqman mixture10μL，上游引物 (10μmol/L)0.4μL，下游引物(10μmol/L)0.4 μL，探針 (10μmol/L)0.4μL，Template DNA 2μL，加無(wú)菌水至20μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用relative quantification study分析方法，相對(duì)表達(dá)量采用的指標(biāo)為 2－ΔΔCt(Ct為循環(huán)值)。

2.3.3 采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清TNF-α量 取分離凍存的大鼠血清按照試劑盒說明書方法步驟，用酶標(biāo)儀檢測(cè)TNF-α 量。

3 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。連續(xù)性變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)”表示，多樣本均數(shù)間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 對(duì)心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-α蛋白的影響連續(xù)處理4周，急性心肌梗死2周后心室重構(gòu)模型組大鼠左室心肌組織TNF-α蛋白量顯著升高，與假手術(shù)組比具有顯著性差異 (P＜0.01);苓桂術(shù)甘湯各劑量組及卡托普利組大鼠心肌組織TNF-α蛋白量顯著降低，與模型組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，表明苓桂術(shù)甘湯能夠顯著地抑制模型大鼠心肌組織TNF-α蛋白的過度表達(dá)。結(jié)果見圖1、2。

圖1 對(duì)心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-α蛋白的影響

圖2 各組大鼠左心室心肌組織TNF-α蛋白表達(dá)

4.2 對(duì)心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-αmRNA表達(dá)的影響 連續(xù)處理4周，急性心肌梗死2周后心室重構(gòu)模型組大鼠左室心肌組織TNF-αmRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，與假手術(shù)組比較具有顯著性差異 (P＜0.01);苓桂術(shù)甘湯各劑量組及卡托普利組大鼠左室心肌組織TNF-αmRNA表達(dá)則明顯降低，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，表明苓桂術(shù)甘湯能夠顯著地抑制模型大鼠心肌組織TNF-αmRNA表達(dá)。結(jié)果見表1、圖3。

表1 對(duì)心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-αm RNA表達(dá)的影響(±s，n=6)

表1 對(duì)心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-αm RNA表達(dá)的影響(±s，n=6)

注:與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，＊＊P ＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1) Ct值假手術(shù)組 －32.034±0.118模型組 － 27.871±0.132△△苓桂術(shù)甘湯小劑量組 2.100 29.817±0.662＊＊苓桂術(shù)甘湯中劑量組 4.200 30.646±0.518＊＊苓桂術(shù)甘湯大劑量組 8.400 31.645±0.229＊＊卡托普利組 0.004 30.914±0.622＊＊

圖3 各組大鼠心肌組織TNF-αm RNA的相對(duì)表達(dá)量

4.3 對(duì)心室重構(gòu)模型大鼠血清TNF-α量的影響 連續(xù)處理4周后，急性心肌梗死2周后心室重構(gòu)模型組大鼠血清TNF-α量顯著增加，與假手術(shù)組比具有顯著性差異 (P＜0.01);苓桂術(shù)甘湯各劑量組及卡托普利組大鼠血清TNF-α量顯著降低，與模型組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，表明苓桂術(shù)甘湯能夠顯著地降低模型大鼠血清TNF-α量。結(jié)果見表2。

表2 對(duì)心室重構(gòu)模型大鼠血清TNF-α量的影響(±s)

表2 對(duì)心室重構(gòu)模型大鼠血清TNF-α量的影響(±s)

注:與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組 別 動(dòng)物/只劑量/(g·kg－1)TNF-α/(ng·L－1)假手術(shù)組10 － 97.101±13.564模型組 8 － 178.129±24.160△△苓桂術(shù)甘湯小劑量組 9 2.100 153.346±14.072*苓桂術(shù)甘湯中劑量組 10 4.200 128.640±19.704＊＊苓桂術(shù)甘湯大劑量組 10 8.400 139.939±21.282＊＊卡托普利組 10 0.004 135.036±9.856＊＊

5 討論

慢性心力衰竭臨床表現(xiàn)復(fù)雜，屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“心悸”、“痰飲”、“水腫”等范疇，系本虛標(biāo)實(shí)之證。“心臟屬火，為陽(yáng)中之太陽(yáng)。上居于胸，秉火陽(yáng)之權(quán)威，震懾下焦水寒之邪不敢越雷池一步”?！靶年?yáng)一虛，則坐鎮(zhèn)水寒之權(quán)威失勢(shì)，下焦水寒陰氣便有上乘之機(jī)”，乃有“心水”發(fā)生［5］。陽(yáng)虛飲停日久則致血行瘀滯不利，久者歷歲，漸見心悸怔忡，少尿水腫等虛、痰、瘀兼夾之候。其病理重點(diǎn)當(dāng)責(zé)之于心之陽(yáng)氣虛衰，心陽(yáng)氣虛是本病的發(fā)病關(guān)鍵，是貫穿其始終的基本病理，以溫陽(yáng)益氣為首要［6］。苓桂術(shù)甘湯是漢《傷寒雜病論》溫心陽(yáng)化水飲之代表方，由桂枝、茯苓、白術(shù)和甘草組成，本方內(nèi)寓桂枝甘草湯，此乃仲景用以溫心陽(yáng)者，柯琴《傷寒附翼》視之為“溫心陽(yáng)之峻劑”;桂苓相輔，則溫陽(yáng)化氣，消飲寧心;白術(shù)協(xié)茯苓，培土以制水。配伍謹(jǐn)嚴(yán)，臨床效著［5，7-8］。

現(xiàn)代研究表明心臟受損后神經(jīng)內(nèi)分泌因子網(wǎng)絡(luò)激活，誘導(dǎo)心室重構(gòu)的發(fā)生，并最終導(dǎo)致心功能惡化，進(jìn)展為慢性心力衰竭。TNF-α作為細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因子之一，在心肌受損后的心室重構(gòu)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［9］。TNF-a是由激活的巨噬細(xì)胞分泌的一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集和炎性遞質(zhì)的釋放，通過心肌局部自分泌和旁分泌參與對(duì)心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的調(diào)控［10］。一方面通過促進(jìn)IL-1、IL-6和hs-CRP等細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)控炎癥的發(fā)生與發(fā)展［11-12］，另一方面通過激活Caspase參與心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控，同時(shí)還通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶參與心肌纖維化的調(diào)控［13］，還可通過刺激心肌細(xì)胞膜IκB降解，進(jìn)而激活NK-κB表達(dá)，導(dǎo)致依賴NK-κB激活的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄并與核DNA結(jié)合增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死、凋亡［14］。因此，TNF-α在心肌損傷后發(fā)揮著刺激心肌細(xì)胞肥大，促進(jìn)心肌細(xì)胞壞死，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞外基質(zhì)改變，影響膠原的合成促進(jìn)基質(zhì)分解等作用，最終導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)破壞、功能受損，促進(jìn)心室重構(gòu)及心衰發(fā)生、發(fā)展［15］。

2009 年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)和心臟學(xué)會(huì)聯(lián)合發(fā)布的《心力衰竭指南》指南強(qiáng)調(diào)早期干預(yù)對(duì)減少心衰發(fā)生、改善患者預(yù)后以及降低整體醫(yī)療成本有著積極的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)在既往研究基礎(chǔ)上，觀察苓桂術(shù)甘湯對(duì)急性心肌梗死后早期干預(yù)對(duì)慢性心力衰竭的防治作用及機(jī)制。研究結(jié)果顯示，在急性心肌梗死后2周用苓桂術(shù)甘湯連續(xù)干預(yù)4周，模型大鼠心肌組織TNF-α、TNF-αmRNA的表達(dá)及血清TNF-α量均明顯降低，表明抑制炎癥因子TNF-α過度激活是該方阻抑心室重構(gòu)、防治心力衰竭作用的重要機(jī)制之一。關(guān)于苓桂術(shù)甘湯對(duì)其他炎癥因子及神經(jīng)內(nèi)分泌因子的調(diào)控作用已另文發(fā)表或正待發(fā)表。

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