黃鈾新，羅耀玲，劉 瑤

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1.核醫(yī)學(xué)科;2.臨床醫(yī)學(xué)研究中心;3.消化內(nèi)科，江西贛州341000)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高度惡性的腫瘤，全世界每年因該病導(dǎo)致的死亡人數(shù)過(guò)百萬(wàn)，過(guò)去的20年中HCC發(fā)病仍呈上升趨勢(shì)［1］。HCC的發(fā)生是多步驟、多因素、多基因參與的過(guò)程。近年發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤組織中存在印記基因的印記缺失所致的等位基因高表達(dá)現(xiàn)象。遺傳印記基因DLK1(delta drosophila homolog-like或 deltalike1 homologue)在HCC中有高表達(dá)，且對(duì)HCC有特異性，被認(rèn)為是一個(gè)潛在的靶標(biāo)［2－3］。

DLK1首先在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中被發(fā)現(xiàn)并克隆，是表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)家族成員之一，參與細(xì)胞分化和決定［4－5］。近年來(lái)研究證實(shí)DLK1在許多腫瘤組織中高表達(dá)，通過(guò)多種機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究意在揭示DLK1的印記缺失與肝癌惡性分化程度、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系。本研究在肝癌細(xì)胞系HepG2上證實(shí)去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)是否能重新誘導(dǎo)DLK1被印記并抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)特征，探索去甲基化藥物對(duì)肝癌的治療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

5-Aza-CdR(Sigma公司)，用 PBS緩沖液(pH 6.8)配制成濃度為5 mmol/L的貯存液，除菌過(guò)濾后分裝于－20℃保存。Trizol(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根公司)。所有引物均由上海生工公司合成。Matrigel(BD公司)，Transwell小室(Coster公司)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))按37℃ 5%CO2培養(yǎng)于含10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液中(Gibco公司)。實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞均是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的，且活細(xì)胞數(shù)要在95%以上。

1.2.2 MTT法檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞的生長(zhǎng):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化后按每孔2×103個(gè)(100 μL)接種于96孔培養(yǎng)板中，4 h貼壁后棄完全培養(yǎng)基，分別加入含新鮮配制的終濃度為0.75、1.5、2.5、5 和10 μmol/L 5-Aza-CdR 藥液的完全培養(yǎng)基，每孔100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔;對(duì)照組加入等量的不含藥液的完全培養(yǎng)基。每隔24 h取出1板加入5 g/L MTT 溶液10 μL，37℃ 繼續(xù)孵育4 h后加DMSO 150 μL，振蕩10 min使其充分溶解結(jié)晶，置酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司)上測(cè)定波長(zhǎng)470 nm的A值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(inhibition ratio)=(1－實(shí)驗(yàn)組A470nm/對(duì)照組A470nm)×100%。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)用藥前后DLK1 mRNA的表達(dá):用新鮮配制的終濃度為2.5和5 μmol/L 5-Aza-CdR處理HepG2細(xì)胞72 h(每天更換含藥液的培養(yǎng)基)后，對(duì)照組用不加藥液的完全培養(yǎng)基。收集細(xì)胞，提取總RNA(按試劑盒說(shuō)明操作)，電泳鑒定總RNA提取效果，定量后進(jìn)行RT-PCR。DLK1基因的上游引物:5'-GTACTCGGGAAAGGACYGCC-3'，下游引物:5'-CTCGCAGAAATTGCCTGAGA-3'，擴(kuò)增 PCR理論長(zhǎng)度為151 bp。內(nèi)參β-actin上游引物:5'-CTA CAATGAGCTGCGTGTGG-3'，下游引物:5'-AAGGA AGGCTGGAAGAGTGC-3'，擴(kuò)增 PCR理論長(zhǎng)度為416 bp。共同PCR條件為:94℃變性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)5-Aza-CdR干預(yù)前后DLK1蛋白表達(dá)水平:將 PBS、2.5 和5 μmol/L 5-Aza-CdR處理72 h的 HepG2細(xì)胞放置冰上，冰PBS洗3遍，加入含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min。然后用干凈的刮棒將細(xì)胞刮下轉(zhuǎn)移到離心管中，4℃ 12 000 r/m離心5 min，上清即為總蛋白。定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(各組總蛋白上樣量均為40 μg)分離蛋白并電轉(zhuǎn)PVDF膜，通過(guò)脫脂奶粉封閉，一抗孵育，洗滌膜，二抗孵育，洗滌膜過(guò)程，最后暗室顯影，拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期:收集2.5和5 μmol/L 5-Aza-CdR(每天換藥)與 PBS 作用72 h的HepG2細(xì)胞，PBS洗滌2次，按9∶1的比例加入70%冰乙醇－20℃固定2 h。PBS沖洗2遍后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，按照PI試劑盒說(shuō)明(碧云天公司)配制碘化丙啶(PI)染色液(終濃度為200 mg/L RNase A和終濃度為50 mg/L)，37℃避光作用30 min后，24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力:4℃溶解Matrigel基質(zhì)過(guò)夜，用預(yù)冷的無(wú)血清1640按1∶5稀釋鋪膠。每孔中加入稀釋好的基質(zhì)膠40 μL，放入37℃培養(yǎng)箱中，孵育5 h;然后吸出小室中水份，進(jìn)行水化基底膜30 min。消化細(xì)胞(2.5和5 μmol/L 5-Aza-CdR與PBS作用72 h的HepG2細(xì)胞)并用無(wú)血清1640懸浮，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2×106個(gè)/mL，每個(gè)Transwell小室中加100 μL細(xì)胞懸液。24孔板下室加入600 μL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。37℃5%CO2培養(yǎng)24 h后，棄去孔中培液，PBS洗2遍，甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，用清水洗3遍以上，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞。400倍顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多個(gè)樣本平均數(shù)間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR作用后HepG2細(xì)胞的增殖活性降低

5-Aza-CdR呈時(shí)間和濃度依賴性抑制HepG2細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖抑制率與濃度呈正相關(guān)(表1)。

2.2 藥物作用后DLK1基因mRNA表達(dá)水平下降

5 μmol/L 5-Aza-CdR藥物處理組細(xì)胞的 DLK1

mRNA表達(dá)量顯著低于PBS作用組(P＜0.05)(圖1)。

2.3 5-Aza-CdR干預(yù)后DLK1蛋白表達(dá)水平下降

PBS、2.5 和5 μmol/L 5-Aza-CdR 處理 HepG2細(xì)胞72 h后，DLK1蛋白表達(dá)水平依次降低(圖2)。

2.4 5-Aza-CdR作用后HepG2細(xì)胞周期改變

PBS、2.5 和5 μmol/L 5-Aza-CdR 處理72 h后，G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多(表2)。

圖1 不同組mRNA灰度值柱形圖比較Fig 1 Relative mRNA of different group(n=3)

表1 5-Aza-CdR對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Table 1 Inhibitory effect of 5-Aza-CdR on HepG2 cell(x ± s，n=3)

圖2 5-Aza-CdR作用HepG2細(xì)胞前后DLKI蛋白表達(dá)水平Fig 2 The DLK1 protein expression of HepG2 cell treated by 5-Aza-CdR

表25 -Aza-CdR對(duì)HepG2細(xì)胞周期影響Table 1 Effect of 5-Aza-Cd on HepG2 cell cycle(n=2)

2.5 5-Aza-CdR處理HepG2細(xì)胞后侵襲能力減弱

各組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)為:PBS組55.4±6.1，2.5 μmol/L 5-Aza-CdR 組為 40.0 ± 3.4，5 μmol/L 5-Aza-CdR組為26.0±3.8。各組間差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

DLK1基因是一個(gè)父源表達(dá)，母源沉默(CpG島的序列上甲基化)的印記基因，定位于人染色體14q32［6］，蛋白具有6次跨膜結(jié)構(gòu)，其中細(xì)胞外區(qū)擁有6串表皮生長(zhǎng)因子樣(EGF)重復(fù)片段，故DLK1屬于表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族成員之一［7］。DLK1與Notchl配體delta存在高度同源性，借助胞外EGF樣的串聯(lián)結(jié)構(gòu)與Notchl相互作用，進(jìn)而聯(lián)系Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路［8］，參與細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞外生物活性。當(dāng)Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路出現(xiàn)異常，由于DLK1與Notch配體的競(jìng)爭(zhēng)，因此導(dǎo)致DLK1表達(dá)異常。近年來(lái)研究表明DLK1在多種腫瘤中出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象。Huang CC［9］等發(fā)現(xiàn)DLK1基因在原發(fā)性肝癌中印跡缺失，導(dǎo)致DLK1基因過(guò)表達(dá)。在肝癌組織中，DLK1的表達(dá)較癌旁組織明顯增加，正常肝組織中未見(jiàn)DLK1的表達(dá)。

5-Aza-CdR是胞苷類似物，一種去甲基化制劑，其作用機(jī)制是通過(guò)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合 (可逆)，從而控制印記基因的表達(dá)水平［10］。本研究首先做了5-Aza-CdR作用HepG2細(xì)胞后的生長(zhǎng)曲線，證實(shí)24 h抑制效果很弱，72 h抑制效果才明顯，因此后面的實(shí)驗(yàn)均采用作用72 h。由于5-Aza-CdR在37℃易分解，只能穩(wěn)定24 h，所以作用72 h一定要每天更換含藥液的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)采用去甲基化試劑5-Aza-CdR處理，觀察對(duì)DLK1基因的影響。結(jié)果HepG2細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR處理降低了DLK1基因mRNA的表達(dá)水平，且降低的水平呈濃度依賴性。

MTT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)具體抑制率與接種細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)，72 h后由于細(xì)胞長(zhǎng)的太滿而抑制率降低。因此96孔板接種的細(xì)胞數(shù)量最好不超過(guò)2×103個(gè)。MTT實(shí)驗(yàn)得出 5-Aza-CdR 在5 μmol/L與10 μmol/L時(shí)抑制效果相差不大，為盡量減少藥物本身影響，后續(xù)試驗(yàn)均采用5 μmol/L為最大濃度，并選用了一個(gè)次之的2.5 μmol/L的濃度做次對(duì)照。流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在S期;Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)5-Aza-CdR作用后腫瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。在做Transwell實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要注意每組細(xì)胞加進(jìn)孔的數(shù)量一定要一致，否則沒(méi)有意義。由于HepG2細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)，24孔板中細(xì)胞加入量最好不超過(guò)3×105個(gè)/mL。

總之，此次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了5-Aza-Cd能重新誘導(dǎo)DLK1被印記，并抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)特征。

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