謝惜媚，陳 彬，劉 嵐，彭 俊，徐愛國，蔣思萍，陸慧寧

(1.中山大學測試中心，廣東廣州 510275;2.西藏自治區(qū)高原生物研究所，西藏自治區(qū)拉薩 850001;3.中山大學化學與化學工程學院，廣東廣州 510275)

紅景天 (Rhodiola)是景天科紅景天屬多年生草本植物，在西藏有32種，具有海拔分布特性，可生長在3 000～5 600 m的灌叢、石縫及亂石灘等環(huán)境中。該屬植物的大多數(shù)種的根莖可入藥，其中大花紅景天 (Rhodiola crenulata)、柴胡紅景天(Rhodiola bupleuroides)和長鞭紅景天 (Rhodiola fastigiata)等為藏醫(yī)用藥的主要種屬，均有抗缺氧、抗疲勞的功效，還有治療心血管疾病和肺結(jié)核的功效［1］。臨床上紅景天已開始用于預防高原反應、延緩衰老，治療冠心病、心絞痛、心律失常、抗腫瘤及化療的輔助用藥［2］，崔艷梅等［3］對紅景天屬植物化學成分及藥理作用研究進展作了較系統(tǒng)的綜述，紅景天活性成分主要為紅景天苷、紅景天素及紅景天多糖等。Yang等［4］從大花紅景天根醇溶性部分分離鑒定了37個化合物，其中包含在紅景天中新發(fā)現(xiàn)的11個木質(zhì)素及1個苯丙腈化合物，37個化合物對α－葡萄糖苷酶均具有強烈的抑制活性。對西藏紅景天揮發(fā)油化學成分研究的相關(guān)報道主要都采用水蒸汽蒸餾提取、氣質(zhì)聯(lián)用分析法，含量較高的揮發(fā)性成分有香葉醇、正辛醇和芳樟醇等［5－7］，Lei等［8］采用 GC-MS 分析比較了西藏大花紅景天與云南大花紅景天的揮發(fā)油成分，Wang等［9］采用HS-GC-TMS法分析了高山紅景天與圣地紅景天的揮發(fā)性化合物。Ljuba等［10］采用GC-MS分析比較了保加利亞、中國和印度的三個薔薇紅景天樣品的揮發(fā)油成分。保加利亞紅景天主要成分是香葉醇其次是桃金娘烯醇;中國紅景天主要成分是香葉醇，其次是正辛醇;印度紅景天主要成分是苯乙醇，其次是桃金娘烯醇和正辛醇。

目前開發(fā)應用最為成熟的是大花紅景天，已有多種藥品和功能性飲品。青藏高原獨特氣候造成大多數(shù)植物生長緩慢，某些紅景天種屬的大量采掘?qū)е逻@些品種逐漸面臨瀕危的境地，尋找其他替代品種成為了迫切的工作。本文采集到了西藏不同地區(qū)紅景天的5個種屬12個樣品，采用HS-GC-MS的方法對所采集的紅景天樣品進行揮發(fā)性化學成分及相對含量進行分析，比較了它們成分上的異同以及總離子流圖的相似度。結(jié)合指紋圖譜分析，該方法還可以為紅景天藥材種屬和產(chǎn)地鑒別提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器及條件

美國Thermo Fisher Scientific TSQ Quantum XLS串聯(lián)四級桿氣－質(zhì)聯(lián)用儀，帶TriPlus RSH三合一自動進樣器 (采用自動頂空進樣功能)。色譜柱TG－5SILMS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，載氣He，流量1 mL/min;進樣針保溫100℃，進樣口溫度250℃，進樣量 1 mL，分流進樣，分流比20∶1;柱起始溫度50℃，保持3min，以5℃/min升至100℃，然后以10℃/min升至200℃，再以20℃/min升至250℃保持1 min;電離方式EI;接口溫度250℃，離子源溫度250℃;電離能70 eV;倍增器電壓800 V;采用Q3MS全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍29～500 amu。標準譜庫為美國NIST 11譜庫。

1.2 樣品采集、鑒定與處理

樣品采自西藏拉薩、山南、林芝和那曲等地區(qū)9縣。樣品經(jīng)西藏高原生物研究所李暉研究員鑒定，6個為大花紅景天，2個為小叢紅景天 (Rhodiola dumulosa)，2個為長鞭紅景天，1個為喜馬紅景天，1個為柴胡紅景天 (見表1)。樣品切片、陰干，用粉碎機粉碎，過50目篩，玻璃瓶儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 紅景天樣品Table 1 The Rhodiola amples

1.3 實驗條件的選擇

1.3.1 取樣量的選擇 分別稱取樣品 (準確至1 mg)0.50、1.00、1.50 g于20 mL頂空瓶中，100℃恒溫30 min，間歇自動震蕩10 s，停止10 s。各取1.0 mL頂空氣體進樣實驗，結(jié)果顯示取樣量1.00 g的總離子流圖各峰形強度及對稱性為最佳。

1.3.2 平衡時間及平衡溫度的選擇 各取樣品1.00 g(準確至1 mg)分別進行平衡溫度80、100、120℃平衡時間10、20、30、40 min的正交實驗，得出平衡時間30 min、平衡溫度100℃為最佳實驗條件。

1.3.3 參照物及加入量的選擇 首先考慮所選參照物是所測樣品中不含該成分，且該化合物與所測揮發(fā)性成分性質(zhì)接近，同時能夠基線分離。初步實驗結(jié)果顯示，所有檢測的紅景天樣品中均不含薄荷腦成分，因此選擇了薄荷腦作為參照物。各取1.00 g(準確至1 mg)樣品分別加入濃度為12.58 mg/mL的薄荷腦/甲醇溶液3.0、5.0、10.0 μL在上述條件下進行實驗，結(jié)果顯示在此范圍內(nèi)薄荷腦的加入量與峰面積之間線性關(guān)系良好，R2=0.998。選擇1.00 g樣品加入3.0 μL上述參照物溶液進行測試，能使參照物峰強度落在樣品中各揮發(fā)性成分峰的強度之間。

1.3.4 樣品測試條件 取紅景天樣品約1.00 g置20 mL頂空瓶中，加入濃度為12.58 mg/mL的薄荷腦/甲醇溶液3.0 μL，在100℃震蕩加熱30 min，進樣針100℃預熱，抽取1.0 mL上層氣體，按“1.2.1 儀器及條件”進樣。

1.4 重復性實驗

取同一種大花紅景天樣品1.00 g(準確至1 mg)6份，每份加入濃度為12.58 mg/mL的薄荷腦/甲醇溶液5.0 μL，分別進行測試分析，計算該樣品中檢測到的21個揮發(fā)性成分與參照物的相對峰面積，結(jié)果見表2。

表2 大花紅景天樣品的重復性實驗結(jié)果Table 2 Relative peak areas of different volatile components

從表2結(jié)果可以看出，同一樣品進行6個平行樣測試，21個揮發(fā)性成分與參照物的相對峰面積的RSD＜8.5%(n=6)，由此可見本方法用于紅景天樣品中微量的揮發(fā)性成分測定是可行的。

2 樣品測試與結(jié)果討論

2.1 樣品測試

按照取樣品1.00 g(準確至1 mg)于20 mL頂空瓶中，加入濃度為12.58 mg/mL的薄荷腦/甲醇溶液3.0 μL，100℃平衡30 min，抽取上層氣體1.0 mL頂空進樣的測試條件，分別對12種紅景天樣品進行測試，每個樣品各進行2次平行試驗，各種紅景天典型的總離子流圖見圖1;12種樣品共檢出30個組分 (表3中序號為27的成分是內(nèi)標物)，檢索結(jié)果見表3;計算樣品中各組分與參照物薄荷腦的相對峰面積，2次平行測試結(jié)果取平均值見表4;用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) (2004A版)計算各樣品與6號樣品譜圖的相似度見表5。

圖1 12種紅景天揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile composition from twelve Rhodiolas

2.2 結(jié)果討論

2.2.1 成分定性和相對量比較 表3列出了12個樣品所含共30個揮發(fā)性成分的定性鑒定結(jié)果。大花紅景天含其中的25個成分，含量較高的成分是正辛醇、芳樟醇、甲基庚烯酮和傘花烴等。據(jù)文獻報道，用水蒸汽蒸餾法提取的西藏大花紅景天主要揮發(fā)性成分為香葉醇、正辛醇和芳樟醇等。本實驗采用直接頂空法測定的大花紅景天主要成分為正辛醇及芳樟醇，與文獻報道基本一致。由于頂空平衡溫度相對較低，高沸點的香葉醇測定結(jié)果比水蒸汽蒸餾法偏低。長鞭紅景天含其中24個成分，含量較高的成分是正辛醇、芳樟醇、甲基庚烯酮、傘花烴和香葉醇等，與大花紅景天比較接近，不同的是該品種含有反式－松香芹醇。小從紅景天含有13個揮發(fā)性成分，含量較高的成分是正辛醇和甲基庚烯酮，還含有大花紅景天所沒有的苯乙醇。喜馬紅景天含有其中12個成分，含量較高的成分是苯乙醇 (相對峰面積0.35，占該樣品揮發(fā)性成分相對含量31.4%)，大花紅景天及長鞭紅景天均不含有該成分。柴胡紅景天僅含6個揮發(fā)性成分，主要揮發(fā)性成分則是β－蒎烯 (相對峰面積1.39，占該樣品揮發(fā)性成分相對含量75.4%)。

表3 紅景天揮發(fā)性成分檢索結(jié)果Table 3 Chemical components of volatile composition from Rhodiolas

表4 紅景天揮發(fā)性成分相對含量 (以與內(nèi)標物的相對峰面積表示)Table 4 Relative contents of volatile composition from Rhodiolas(represent by the relative peak area with internal standard)

在表4中，用添加的參照物薄荷腦 (保留時間15.09 min)的峰面積校準各成分在不同樣品中的相對含量，使表4的數(shù)據(jù)間具備可比性。

統(tǒng)計表4數(shù)據(jù)，樣品1至12的揮發(fā)物總量(相對峰面積總和)依次為:10.9，6.1，6.5，6.8，5.9， 12.6，3.4， 10.3，1.5， 2.0， 1.1、1.8?？梢钥闯觯瑯悠?、10、11、12的總揮發(fā)物含量與其他樣品相比偏少。

以上定性和定量結(jié)果表明，長鞭紅景天揮發(fā)性成分及含量與大花紅景天較接近，而小叢紅景天、喜馬紅景天和柴胡紅景天與大花紅景天相比差異較大。

2.2.2 TIC譜圖的相似度比較 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，以峰較多的6號大花紅景天樣品為參照，對其它11種紅景天樣品的TIC圖進行比較分析，結(jié)果列于表5。由表5可見:采自不同地區(qū)的大花紅景天樣品相似度較高，基本都在0.9以上 (其中2號樣品的相似度偏低，樣品中氧化芳樟醇含量比芳樟醇高，這可能與樣品處理過和保存過程的偶然因素有關(guān)，原因有待考證)。樣品7、8是同地區(qū)不同季節(jié)采集的兩個長鞭紅景天樣品，它們與6號大花紅景天譜圖相似度分別是0.831和0.870，在所分析的5個紅景天品種中，長鞭紅景天與大花紅景天的相似度最高。將兩個長鞭紅景天進行對比，相似度為0.856，顯示由于采集季節(jié)不同，揮發(fā)性成分存在一定差異。樣品9、10是不同季節(jié)采自不同地區(qū)的小叢紅景天，與6號大花紅景天譜圖相似度分別是0.623和0.655，差異比較大，同樣對兩個小叢紅景天樣品的TIC譜圖比較，相似度為0.710，顯示由于采集季節(jié)和地區(qū)不同，樣品間差異較大。樣品11是喜馬紅景天，樣品12是柴胡紅景天。它們與6號大花紅景天相比，其相似度分別為0.483和0.433，存在很大差異。

表5 各樣品與6號樣品TIC譜圖的相似度Table 5 The TIC similarity between 6 and other samples

以上分析得到初步結(jié)論:紅景天的TIC譜圖相似度與品種、采樣季節(jié)和產(chǎn)地相關(guān)。其中相同品種、相同采樣季節(jié)、不同產(chǎn)地間差異較小 (如5個大花紅景天間相似度在0.9以上)。品種間差異較大 (5個種屬相似度在0.8～0.4之間);同品種、同產(chǎn)地不同采樣季節(jié)也存在一定差異 (如7、8的相似度約為0.85);同品種、不同產(chǎn)地不同采樣季節(jié)的差異進一步擴大 (如9、10間的相似度約為0.7，基本符合產(chǎn)地和季節(jié)兩個因素的疊加)。由此得到結(jié)論:相似度受品種、采樣季節(jié)和產(chǎn)地三個因素的影響程度依次降低。

成分定性和相對量分析結(jié)果與色譜指紋圖譜相似度評價結(jié)果相當一致。前者從化學結(jié)構(gòu)的角度解析每個揮發(fā)性成分，作為基礎研究是必不可少的。后者從統(tǒng)計學的角度評價樣品之間的相似程度更為系統(tǒng)和科學。兩者相結(jié)合，更有利于對不同種屬、采集季節(jié)和產(chǎn)地的紅景天進行全面地鑒別和評估。

［1］倪志誠.西藏經(jīng)濟植物志［M］.北京:科學技術(shù)出版社，1990:250－262.

［2］鄭虹，馬軍杰.紅景天適應原樣作用的研究進展［J］.高原醫(yī)學雜志，2005，15(3):62－64.

［3］崔艷梅，婁安如，趙長琦.紅景天屬植物化學成分及藥理作用研究進展［J］.北京師范大學學報:自然科學版，2008，44(3):328－333.

［4］YANG Yanan，LIU Zhaozhen，F(xiàn)ENG Ziming，et al.Lignans from the root ofRhodiola crenulata［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60:964－972.

［5］黃榮清，吳德雨，駱傳環(huán)，等.氣相色譜－質(zhì)譜法分析西藏紅景天揮發(fā)油成分［J］.中國中藥雜志，2006，31(8):693－694.

［6］韓泳平，陳胡蘭，宋學偉，等.藏藥大花紅景天揮發(fā)油化學成分的氣相色譜－質(zhì)譜分析［J］.華西藥學雜志，2005，20(2):104－106.

［7］韓泳平，宋學偉，李遠森，等.大花紅景天揮發(fā)性提取物制備方法比較研究［J］.中國藥學雜志，2005，40(13):973－974.

［8］LEI Yidong，NAN Peng，TSERING Tashi，et al.Interpopulation variability of rhizome essential oils inRhodiola crenulatafrom Tibet and Yunnan，China［J］.Biochemical Systematics Ecololgy，2004，32(6):611－614.

［9］WANG Haoyang，GUO Yinlong.Rapid analysis of the volatile compounds in the rhizomes ofRhodiola sachalinensisandRhodiola sacraby static headspace-gas chromatography– tandem mass spectrometry［J］.Analytical Letters，2004，37(10):2151–2161.

［10］LJUBA Evstatieva，MILKA Todorova，DANIELA Antonova，et al.Chemical composition of the essential oils ofRhodiola roseaL.of three different origins［J］.Pharmacognosy Magazine，2010，6(24):256－258.