黃奇駿 姚 婕 黎玉君 翁合妹 龔嘉欣 丘翠環(huán) 楊永霞

廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院物理與電子學(xué)教研室，廣東廣州 510006

口腔癌是一類發(fā)生于唇、腭、舌、口底和牙齦等部位的上皮源性惡性腫瘤。目前口腔癌多采用以手術(shù)為主的治療方法，但術(shù)后患者5年生存率只有50%左右，同時(shí)還具有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[1]。核磁共振1H 譜（nuclear magnetic resonance1H，NMR1H）是研究生物樣品代謝變化的一種常用手段，近年來(lái)基于核磁共振的代謝組學(xué)方法已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[2-6]。本文應(yīng)用核磁共振1H 譜并結(jié)合多變量分析方法研究口腔癌患者血清的代謝組特征，尋找與癌變相關(guān)的血清代謝標(biāo)志物，闡明口腔癌患者血清生化過(guò)程的改變。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

于廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院收集口腔癌患者血清樣本10例和健康人血清10例（收集時(shí)間：2011年11月～2012年4月），置-80℃超低溫冰箱貯存。

1.2 樣品預(yù)處理

采樣前，將所有血清樣本解凍，在4℃下，10 000 g 離心10 min。取400 μL 上層血清加至5 mm NMR 測(cè)試管中，后加入100 μL 0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L Na2HPO4-0.2 mol/L NaH2PO4，pH＝7.4）和 50 μL 重水，振蕩混勻。

1.3 NMR 實(shí)驗(yàn)

每一個(gè)樣品均采集 Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG，relaxation delay-90-（τ-180-τ）n-acquisition） 氫譜，總回波時(shí)間為100 ms，3 s 延遲時(shí)間，64k 數(shù)據(jù)點(diǎn)， 采集次數(shù)為128?；瘜W(xué)位移定標(biāo)為乳酸甲基雙重峰δ1.33。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用軟件TOPSPIN 2.0對(duì)所有1H CPMG 譜進(jìn)行自動(dòng)積分，積分區(qū)間δ0.5～4.6，積分間隔0.01。主成分分析前對(duì)每一個(gè)譜的積分值進(jìn)行歸一化處理，后將歸一化值導(dǎo)入軟件 Simca-P 12.0（Umetrics，Sweden）中進(jìn)行主成分分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS（Version 13.0，SPSS Inc.，USA）軟件對(duì)正常人和口腔癌患者血清代謝物的歸一化積分值做獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康人與口腔癌患者血清CPMG1H 譜比較

由圖1 可清楚地觀察到亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、谷氨酸、乙酰乙酸、谷氨酰胺、甲胺、二甲胺、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、膽堿和葡萄糖等信號(hào)峰。對(duì)比健康人與口腔癌病人血清CPMG1H 譜，可以發(fā)現(xiàn)膽堿、葡萄糖和乳酸有明顯的變化[7]。為了能夠篩選出具有顯著性差異的代謝標(biāo)志物，將利用主成分分析和統(tǒng)計(jì)分析對(duì)兩組樣本的血清代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖1 為代表性的健康人與口腔癌患者CPMG1H 譜。

圖1 健康者（a）與口腔癌患者（b）血清CPMG1H 譜

2.2 多變量分析

為了篩選出口腔癌患者血清代謝標(biāo)志物，本文采用代謝組學(xué)常用的多變量分析-主成分分析方法對(duì)上述得到的CPMG1H的歸一化積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行分析。主成分分析方法能夠根據(jù)樣本代謝圖譜的特征給出樣本間的分類，同時(shí)還可以篩選出對(duì)區(qū)分有較大貢獻(xiàn)的代謝物（即化學(xué)位移區(qū)間）。對(duì)健康者（○）和口腔癌患者（●）血清CPMG1H 譜的主成分分析結(jié)果見(jiàn)圖 2（PC1 比 PC2，R2＝82.5%）?？梢缘玫娇谇话┗颊哐逯邪被幔涟彼?、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸），谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的，而乳酸和膽堿的含量降低。

3 討論

通過(guò)得分圖（圖2a）可以看到，健康人和口腔癌患者血清樣本在PC2 維可以完全區(qū)分開(kāi)，通過(guò)對(duì)PC2值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明這兩類樣本在PC2 維具有顯著性差異（P＜0.01）。負(fù)載圖（圖2b）給出了兩類樣本中主要的代謝物變化，口腔癌患者血清中氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸），谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的，而乳酸和膽堿的含量降低。進(jìn)一步通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)這些代謝物均具有顯著性差異（P＜ 0.05）。

口腔癌患者血清中乳酸含量是降低的，這可能表明在口腔癌患者血清代謝中無(wú)氧糖酵解過(guò)程減少，這與鼻咽癌血清代謝中乳酸變化一致[8]。磷脂膽堿和膽堿是存在于細(xì)胞膜上的磷脂，而口腔癌患者血清膽堿含量的降低可能與細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞凋亡過(guò)程出現(xiàn)了失衡狀態(tài)有關(guān)。

圖2 健康者（○）和口腔癌患者（●）血清CPMG1H 譜主成分分析（a）得分圖（b）負(fù)載圖

此外，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸在口腔癌患者血清中含量是明顯增加的。糖蛋白和谷氨酸對(duì)免疫功能的維持有重要作用，如提高機(jī)體代謝和改善機(jī)體免疫狀況等。糖蛋白和谷氨酸含量的增加表明其代謝過(guò)程受到調(diào)控，相應(yīng)的調(diào)控功能受到影響[9]。

總之，通過(guò)對(duì)口腔癌患者血清代謝組的研究，并結(jié)合主成分分析方法篩選出了口腔癌患者血清代謝標(biāo)志物，這將為口腔癌診斷提供可靠的分子水平上的代謝證據(jù)。

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