姜春雨，曾常茜

(1.吉林省圖們市石峴鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院藥劑科，吉林 延邊 133101; 2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院·遼寧省生物有機(jī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116622)

對(duì)于大多數(shù)肝癌患者，化學(xué)治療仍為主要的治療手段。然而目前臨床應(yīng)用的抗肝癌藥物在殺傷肝癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)某些正常的細(xì)胞也有一定程度的損害[1－2]。因此，尋找對(duì)肝癌療效好且毒副作用小的藥物成為目前的重要課題。透骨草 Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara為透骨草科植物的干燥全草入藥，具有清熱解表、活血消腫作用[3]。本研究中觀察了透骨草提取物對(duì)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞形態(tài)的影響，并通過檢測(cè)透骨草提取物對(duì)SMMC－7721細(xì)胞p53和p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(PUMA)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討透骨草提取物誘導(dǎo)SMMC－7721細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，旨在為透骨草抗肝癌作用的研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

人肝癌SMMC－7721細(xì)胞，由吉林省腫瘤研究所提供;鼠抗人p53抗體和鼠抗人PUMA抗體(編號(hào)為4976)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，通用型SP試劑盒(批號(hào)為812251A)、DAB顯色試劑盒(批號(hào)為K107715A)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。RPMI 1640(批號(hào)為307964)、小牛血清和胰蛋白酶為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;MTT和DMSO為Sigma公司產(chǎn)品;藥物采自遼寧金州大黑山，經(jīng)王心毓先生鑒定為透骨草科植物。BB16UV型CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)Heraeus公司;CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

透骨草提取物制備方法:采取加熱回流提取法。取干燥透骨草50 g，加8倍量75%乙醇，提取2 h，過濾，濾液水浴濃縮成干膏。

細(xì)胞培養(yǎng):SMMC－7721細(xì)胞使用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，應(yīng)用時(shí)加入青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L和含10%滅活的小牛血清，置37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置顯微鏡觀察檢測(cè)SMMC－7721細(xì)胞形態(tài):選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)良好的SMMC－7721細(xì)胞，將其接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2.0 mL，37℃ 5%CO2孵育12 h。棄去孔中培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次。試驗(yàn)組加入終質(zhì)量濃度為40.91 μg/mL 的透骨草提取物(IC50)2.0 mL，對(duì)照組加入等體積的RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h，觀察倒置顯微鏡下活細(xì)胞形態(tài)變化情況。

免疫組化方法檢測(cè)SMMC－7721細(xì)胞p53和PUMA蛋白的表達(dá):按試劑盒說明進(jìn)行操作。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC－7721細(xì)胞以1.0×105個(gè)/mL細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為40.91 μg/mL的透骨草提取物，另設(shè)RPMI 1640培養(yǎng)液作為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)96 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，消化并收集細(xì)胞，用PBS稀釋SMMC－7721細(xì)胞為1.0×106個(gè) /mL。SMMC －7721細(xì)胞涂片，丙酮固定 20 s，PBS沖洗2 min×3次，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min;滴加正常非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育15 min，棄血清，分別滴加鼠抗人鼠抗人p53抗體、鼠抗人PUMA抗體，37℃孵育2 h，PBS沖洗2 min×3次。滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗2 min×3次，滴加鏈霉菌抗生物素－過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗2 min×3次。加DAB底物混合液，鏡下觀察顯色，自來水終止顯色。蘇木素復(fù)染，封片，置顯微鏡下觀察。在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞核或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕色判斷為陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)棕色染色者為陰性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)SMMC－7721細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察可見，對(duì)照組SMMC－7721細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，密集排列、形態(tài)呈梭形或多邊形，胞體透亮折光性好。40.91 μg/mL透骨草提取物作用于 SMMC－7721細(xì)胞24 h后，細(xì)胞胞體積明顯縮小，形態(tài)不規(guī)則，輪廓不清晰，細(xì)胞皺縮變形，細(xì)胞脫壁增加。

2.2 對(duì)SMMC－7721細(xì)胞p53和PUMA蛋白表達(dá)的影響

免疫組化方法觀察結(jié)果顯示，未用透骨草提取物處理的對(duì)照組SMMC－7721細(xì)胞p53蛋白低表達(dá)，細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量少，經(jīng)40.91 μg/mL透骨草提取物處理后的 SMMC－7721細(xì)胞p53蛋白表達(dá)明顯增高，細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異顯著(P＜0.01);未用透骨草提取物處理的對(duì)照組SMMC－7721細(xì)胞PUMA蛋白低表達(dá)，細(xì)胞漿著棕黃色的細(xì)胞量少，經(jīng)40.91 μg/mL透骨草提取物處理后的 SMMC－7721細(xì)胞PUMA蛋白表達(dá)明顯增高，細(xì)胞漿著棕黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 免疫組化法檢測(cè)SMMC－7721細(xì)胞p53和PUMA蛋白表達(dá)結(jié)果(±s，n=3)

表1 免疫組化法檢測(cè)SMMC－7721細(xì)胞p53和PUMA蛋白表達(dá)結(jié)果(±s，n=3)

注:與對(duì)照組比較，△P ＜0.01。

組別對(duì)照組試驗(yàn)組p53(%)14.4±1.2 7.8±1.8△PUMA(%)15.5±1.6 52.6 ±1.9△

3 討論

筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，透骨草提取物對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞、人乳腺癌 MCF－7細(xì)胞、人宮頸癌胞 Hela細(xì)胞、人肝癌HepG－2細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用[4]。本研究中用倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，40.91 μg/mL 透 骨草提取物作用后的SMMC－7721細(xì)胞與對(duì)照組相比，細(xì)胞胞體積明顯縮小，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞皺縮變形，細(xì)胞脫壁增加，從形態(tài)學(xué)上證明透骨草提取物可誘導(dǎo)SMMC－7721細(xì)胞凋亡。

p53基因是重要的腫瘤抑制基因，能影響多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞增殖活化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抑制血管新生等[5]。本研究中通過免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)40.91 μg/mL透骨草提取物處理的SMMC－7721細(xì)胞24 h后，p53蛋白表達(dá)顯著增加，表明透骨草提取物可能通過上調(diào)p53蛋白表達(dá)誘導(dǎo)SMMC－7721細(xì)胞凋亡。

p53基因的抗腫瘤作用有賴于其激活下游靶基因，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期阻滯。PUMA是Bcl－2蛋白家族中促凋亡成員之一，因其含有一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域，亦稱為BH3僅有蛋白，是細(xì)胞凋亡的重要啟動(dòng)子。研究發(fā)現(xiàn)，PUMA是p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期阻滯的靶基因[6－7]，p53的結(jié)合位點(diǎn)位于PUMA的上游啟動(dòng)序列中，感應(yīng)到凋亡刺激信號(hào)后，p53會(huì)結(jié)合其位于上游啟動(dòng)序列中的結(jié)合位點(diǎn)，從而誘發(fā)PUMA轉(zhuǎn)錄及其蛋白表達(dá)[8]。為了進(jìn)一步探究透骨草提取誘導(dǎo)SMMC－7721細(xì)胞凋亡是否與p53下游因子PUMA的表達(dá)相關(guān)，本研究中通過免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，40.91 μg/mL透骨草提取物處理的 SMMC－7721細(xì)胞24 h后，PUMA蛋白表達(dá)顯著增加，表明透骨草提取物可能通過上調(diào)PUMA蛋白表達(dá)誘導(dǎo)SMMC－7721細(xì)胞凋亡。鑒于PUMA對(duì)p53的依賴性，推測(cè)透骨草提取物誘導(dǎo)SMMC－7721細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)p53，進(jìn)而上調(diào)PUMA蛋白表達(dá)有關(guān)。P53/PUMA通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是由多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白參與的復(fù)雜過程，相關(guān)分子機(jī)制有待進(jìn)一步更深入的研究。

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