王倩倩，張美妮

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）慢性自身免疫性炎癥性疾病，主要的病理特點(diǎn)為髓鞘脫失、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和軸索損害。Tau蛋白屬于微管相關(guān)蛋白，主要存在于軸索上，在體外一般認(rèn)為是促進(jìn)微管裝配的因素[1]。Tau蛋白的生理學(xué)作用是穩(wěn)定微管和維持神經(jīng)元形狀和極性[2]。氟西汀是選擇性－5羥色胺（5－HT）再攝取抑制劑，廣泛應(yīng)用于抑郁癥治療，有研究表明氟西汀具有免疫調(diào)節(jié)作用[3]。本研究擬建立實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠模型，探討氟西汀對(duì)EAE小鼠急性期的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 將18g～20g，8周～10周，C57BL／6雌性小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）60只隨機(jī)分為氟西汀組、EAE組和對(duì)照組，每組各20只。

1.2 EAE模型制備 0.01mol／L的PBS將 MOG35－55（武漢博士德公司）稀釋，然后將稀釋液與等量含結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（武漢博士德公司）混合，用玻璃注射器抽吸成油包水狀，制成誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑。氟西汀組和EAE組小鼠背部中央偏頭側(cè)皮下注射抗原乳劑。利用生理鹽水代替MOG35－55稀釋液，參照上述方法制備乳劑，供對(duì)照組使用。各組于免疫后第0天、第2天分別腹腔注射百日咳毒素（美國(guó)Sigma公司），每只600ng作為免疫增強(qiáng)劑。

1.3 給藥方法 氟西汀組于免疫前14d到免疫前1d每日胃管灌入氟西汀（百憂解，生產(chǎn)由Patheon France，分包裝由禮來蘇州制藥有限公司）10mg／kg，EAE組和對(duì)照組于免疫前14d到免疫前1d每日胃管給予等量生理鹽水。

1.4 觀察實(shí)驗(yàn)指標(biāo) 從免疫當(dāng)日起，采用雙人雙盲的方式隔天觀察和評(píng)定小鼠臨床癥狀的嚴(yán)重程度及體重變化（評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)際通用的5分制評(píng)分法）。免疫25d后，10%水合氯醛按0.1mL／20mg腹腔注射麻醉后，小鼠左心取血，左心室灌注磷酸鹽緩沖液至肝臟變白，再使用4%多聚甲醛至尾部僵直，解剖取大腦。用ELISA方法檢測(cè)血清Tau蛋白。用HE染色觀察炎癥及軸索損害情況。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠臨床癥狀評(píng)分 EAE組小鼠于免疫10d后開始陸續(xù)發(fā)病，免疫后13d～20d達(dá)到發(fā)病高峰期，發(fā)病率為80%。發(fā)病時(shí)表現(xiàn)為皮毛不光滑、食欲下降、體重減輕、活動(dòng)量減少；同時(shí)相繼出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀，先是表現(xiàn)為尾部肌張力低下，身體向一側(cè)傾倒，進(jìn)一步進(jìn)展為雙側(cè)后肢無力，不能翻身或翻身力弱，靠前肢爬行，無因病情危重而死亡。20只中4只未發(fā)病。免疫25d后取樣，除未發(fā)病4只的所有小鼠。氟西汀組小鼠于免疫13d后開始陸續(xù)發(fā)病，免疫后13d～20d達(dá)到發(fā)病高峰期，發(fā)病率為80%。癥狀與EAE組相比較輕，20只中有4只未發(fā)病，與EAE組相比，氟西汀組在神經(jīng)功能評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)照組小鼠一直沒出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，體重持續(xù)上升，與EAE組相比，神經(jīng)功能評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s） 分

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s） 分

組別 n 神經(jīng)功能評(píng)分EAE組 16 2.533±0.698氟西汀組 16 1.270±0.3761）對(duì)照組 20 01）與EAE組相比，1）P＜0.01

2.2 血清中Tau蛋白表達(dá)（見表2）

表2 各組Tau蛋白比較（±s） pg／mL

表2 各組Tau蛋白比較（±s） pg／mL

組別 n Tau蛋白EAE組 16 80.710±4.217氟西汀組 16 58.260±5.3661）對(duì)照組 20 19.950±2.8032）與EAE組相比，1）P＜0.01，2）P＜0.001

2.3 組織病理變化 HE染色發(fā)現(xiàn)EAE組小鼠大腦炎性浸潤(rùn)呈典型的“袖套樣”改變，浸潤(rùn)細(xì)胞以淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，并且炎性浸潤(rùn)部位及程度與臨床癥狀密切相關(guān)。氟西汀組小鼠大腦實(shí)質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。對(duì)照組小鼠大腦未見明顯異常改變。

3 討 論

本研究表明氟西汀能促進(jìn)急性期EAE小鼠神經(jīng)功能緩解。Mostert等[4]的研究表明MS患者使用氟西汀之后，使 MRI增強(qiáng)病灶數(shù)目減少。本研究中，組織學(xué)表明EAE組小鼠大腦炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，氟西汀組小鼠大腦炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較EAE組減少。氟西汀的抗炎作用并未完全明確，但是研究表明氟西汀可能通過5－HT的調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用。O’Connell等[5]認(rèn)為氟西汀抑制樹突細(xì)胞從細(xì)胞外環(huán)境攝取5－HT和活化T細(xì)胞（合成5－HT）?？赡軐?dǎo)致減少環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的產(chǎn)生和促進(jìn)初始T細(xì)胞的活化和分化[6]，這可能是治療 MS的一個(gè)機(jī)制。氟西汀提高星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)cAMP信號(hào)傳導(dǎo)，下調(diào)了Ⅱ類反式激活蛋白，從而抑制了促炎因子MCH－Ⅱ[6，7]。這個(gè)機(jī)制可以抑制具有免疫活性的CNS抗原提呈細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。病灶內(nèi)軸索損傷與病灶內(nèi)炎癥程度相關(guān)，表明炎癥是軸索損傷和脫髓鞘的病因。干擾素－γ（INF－γ）是導(dǎo)致髓鞘損傷和修復(fù)免疫介導(dǎo)的脫髓鞘病變的主要促炎性細(xì)胞因子[8]。MS患者和EAE小鼠的CNS中發(fā)現(xiàn)有高濃度的INF－γ蛋白和mRNA，并且和疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[9]。使用抗IFN－γ抗體治療EAE小鼠能減少EAE的發(fā)病率。氟西汀能減少促炎性因子INF－γ、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的釋放，增加抗炎因子白介素－10（IL－10）的釋放[10]。氟西汀通過減少INF－γ，抑制炎癥反應(yīng)，減輕軸索損傷、脫髓鞘以及減少病灶。因此IFN－γ表達(dá)的調(diào)節(jié)可能是氟西汀治療EAE的機(jī)制之一。氟西汀作為MS的候選藥的原因還包括：星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的產(chǎn)生，比如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞糖原分解和鈉離子通道的阻礙[11－13]。鈉離子通道活化和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)糖原分解受損導(dǎo)致減少軸索能量代謝被認(rèn)為在MS患者軸損害中起了很重要的作用[14]。MS患者中，氟西汀提高腦白質(zhì)N－乙酰門冬氨酸／肌酸的比例，而N－乙酰門冬氨酸／肌酸被認(rèn)為是軸索能量代謝的一種指標(biāo)。Tau蛋白被認(rèn)為是軸索損害、疾病進(jìn)展和不可逆神經(jīng)功能缺損的生物學(xué)標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)研究表明氟西汀干預(yù)組和對(duì)照組相比，血液中Tau蛋白濃度顯著減少，神經(jīng)功能評(píng)分差異顯著，認(rèn)為氟西汀促進(jìn)EAE小鼠神經(jīng)功能的緩解。

總之，氟西汀能促進(jìn)急性EAE神經(jīng)功能緩解和抑制CNS脫髓鞘，表明其有神經(jīng)保護(hù)作用。

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