黃杏 楊麗濤 張保青 宋修鵬 李楊瑞 王盛

甘蔗（Saccharum officenarum L.）作為我國最主要的糖料作物，起源于熱帶及亞熱帶地區(qū)，屬喜溫作物。近年來，頻發(fā)的寒害凍害對甘蔗的生產(chǎn)造成了巨大的損失［1-3］。脫落酸（abscisic acid，ABA）是植物對逆境脅迫的防衛(wèi)機制成員之一［4，5］。在逆境條件下，它與ABA結(jié)合蛋白的結(jié)合能力增強，并感知和傳遞環(huán)境信號，以啟動植物體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，提高植物抗御各種逆境因子的脅迫能力［6-8］。在低溫脅迫過程中，內(nèi)源ABA含量顯著增加，表明ABA參與植物低溫脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［9，10］。目前已發(fā)現(xiàn)有150多種基因可受ABA的誘導(dǎo)，其中包括在植物器官中受環(huán)境脅迫誘導(dǎo)表達的基因［11］。脫落酸脅迫成熟誘導(dǎo)蛋白（ABA-/stress-/ripening-induced protein，ASR）是一類親水性極強的小分子熱穩(wěn)定蛋白，其表達調(diào)控受脫落酸、脅迫及成熟的誘導(dǎo)［12］。前人關(guān)于ASR的研究主要集中在果實成熟和衰老方面［13，14］，隨著對ASR研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)它與干旱、鹽脅迫及低溫等非生物脅迫之間也存在著一定的應(yīng)答關(guān)系［15-17］，但目前對此基因的研究還僅限于百合［18］、葡萄、香蕉等少數(shù)植物，且從分子角度研究甘蔗的ASR與環(huán)境脅迫間的關(guān)系鮮有報道。本課題組在前期甘蔗抗寒抗旱的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)，滲透和低溫脅迫下甘蔗體內(nèi)ASR蛋白的表達量發(fā)生了顯著的變化［19］。在此基礎(chǔ)上，本研究運用同源克隆和RT-PCR技術(shù)克隆了甘蔗脫落酸脅迫成熟誘導(dǎo)蛋白（ASR）基因；構(gòu)建了其原核表達載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達；同時利用熒光定量PCR技術(shù)分析了ASR基因在低溫脅迫和ABA處理下的表達模式，為進一步探索ASR基因在逆境脅迫中的生子生物學(xué)功能和甘蔗抗寒分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2011年3 月至2011年12 月在廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室完成。以抗寒性強的甘蔗品種桂糖28號（GT28）和抗寒性弱的甘蔗品種園林6號（YL6）作為研究材料。將兩個甘蔗品種的單芽種莖進行脫毒處理后放進沙盤中進行沙培。待甘蔗長出2-3葉時，將蔗苗從沙中移出，選取長勢一致的甘蔗苗移栽至20cm×25cm（直徑×高）的營養(yǎng)盆中，每盆裝混合土4kg（土∶有機肥∶沙=6∶3∶1，W/W），每盆種植2株，并把營養(yǎng)盆移至智能溫室大棚，按日常管理生長40d，然后轉(zhuǎn)入人工氣候室（溫度為28℃，光強為250-300μmol/m2·s，12h 光 周 期， 相 對 濕 度 60％-70％）培養(yǎng)10d，甘蔗長到5-6葉期時，分組進行處理。第一組處理為低溫+噴施ABA（100μmol/L ABA），記為LA；第二組處理為低溫+噴施清水，記為L（注：噴施程度以葉面噴施欲滴為度，于甘蔗苗進行低溫處理前12h噴施）。低溫處理下，溫度為0℃，光強為 250-300μmol/m2·s，12h光周期，相對濕度60％-70％。分別在處理0、1、7和14d剪取甘蔗+1葉，用液氮速冷后存于-80℃冰箱備用。

大腸桿菌DH5α、凝膠回收試劑盒購自Bioer公司；Dream Taq酶、pMD18-T載體試劑盒、IPTG、X-gal、IPTG、dNTPs均購自TaKaRa寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自上海生工，引物合成及測序由上海生工完成。pET-30a（+）載體和大腸桿菌BL21（DE3）由本實驗室保存。DNA Ligation連接試劑盒、EcoRⅠ、Hind Ⅲ 購自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 甘蔗葉片總RNA提取按北京康為世紀生物科技有限公司Trizol說明書進行，cDNA合成用TaKaRa寶生物工程有限公司M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄引物為Oligo（dT）18：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）18-3'，具體步驟按說明書進行，完成后取4μL PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢查并用紫外分光光度計檢測cDNA 濃度，最后將各處理cDNA濃度稀釋至同一濃度。

1.2.2 SoASR 基因的克隆與生物信息學(xué)分析 以NCBI中已報道的玉米、水稻等物種的ASR 基因為參照，運用NCBI BLAST搜索其對應(yīng)的核酸序列，選取同源性較高的核酸序列進行比對分析并利用DNAMAN軟件設(shè)計該基因上游簡并引物ASR：5'-ATG（T/G）C（T/C/G）（C/G）A（G/A）GAG（C/A）A（G/T）CA（C/T）CACCA-3'，下游引物為逆轉(zhuǎn)錄加尾引物 3 side：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'。獲得該基因全長后在其編碼框首尾設(shè)計引物F：5'-ATGGCCCAAGAGAAGCACCACCACC-3'和 R：5'-TCAGCCGAAGAAGTGGTGCTTCTTC-3'進行擴增以驗證序列準確性。擴增ASR 基因的PCR體系為25μL，模板為不同處理cDNA 等量的混合樣，具體操作按照Dream Taq酶說明書進行。PCR擴增參數(shù)為：95℃預(yù)變性 5min ；95℃ 40s，58℃ 50s，72℃延伸2min，35個循環(huán)；72℃延伸8min。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 ％ 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶后連接pMD18-T載體（TaKaRa）后轉(zhuǎn)化DH5α（Trans Gen）感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，送上海生工測序。

用BioXM 2.6預(yù)測基因氨基酸序列；利用NCBI在線分析軟件檢索各基因與其他物種的同源性；用MEGA 4.0軟件構(gòu)建每個基因與其他物種氨基酸序列的進化樹；在線軟件（http：//isoelectric.ovh.org/）分析基因氨基酸序列的蛋白質(zhì)分子量和等電點大?。挥肳oLF PSORT在線軟件分析基因亞細胞定位；用SOSUI signal軟件預(yù)測基因信號肽；用ExPASy Proteomics Server在線軟件預(yù)測基因的親水性和跨膜結(jié)構(gòu)；用SOPMA軟件預(yù)測基因的二級結(jié)構(gòu)；用Motif Scan在線軟件分析基因蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 SoASR基因的原核表達 以pET-30a（+）為表達載體，根據(jù)SoASR基因ORF，設(shè)計SoASR表達載體構(gòu)建引物SoASR pET-30aF：5'-CGGAATTCA TGGCCCAAGAGAAGCACCACCACC-3'，SoASR pET-30aR：5'-CCAAGCTTTCAGCCGAAGAAGTGGTGCTTC TTC -3'（下劃線部分分別為N端EcoRⅠ酶切位點和C端Hind Ⅲ酶切位點），進行PCR擴增后回收純化后和pET-30a載體分別用EcoRⅠ+Hind Ⅲ進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA Ligation 連接試劑盒連接目的基因與載體，獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），Kan抗性篩選，進行測序和雙酶切鑒定。

將重組菌株在LB 液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600約0.4-0.6，以空載體 pET-30a（+）（BL21）為對照，加入IPTG至終濃度到1mmol/L和2mmol/L，37℃下分別誘導(dǎo)0、2、4和6h，收集菌液各2mL。將所收集菌液于5000r/min離心5min，棄去上清，在向沉淀中加入200μL 3×上樣緩沖液，沸水浴5min，冰上冷卻后，取20μL進行SDS-PAGE 電泳分析（SDS-PAGE 的濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12.5％）。電泳結(jié)束后用0.5％考馬斯亮藍R-250進行染色，成像分析。

1.2.4 SoASR基因的實時熒光定量表達分析 根據(jù)獲得的SoASR 基因全長序列設(shè)計熒光定量PCR特異性引物SoASR QF：5'-GAGTACACGGAGACCACGGT-3'、SoASR QR ：5'-TCTCGTAGAGTGCGAAGGC-3'，以甘蔗25S rRNA基因（BQ536525）為內(nèi)參，設(shè)計內(nèi)參引物25S rRNA QF：5'-GTCAGAAAAGTTACCACAGGGA-3'、25S rRNA QR：5'-GGTAAAACTAACCTGTCTCACGA-3'。熒光定量PCR反應(yīng)在ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀上進行，反應(yīng)體系為20μL，方法參照天根公司熒光定量試劑盒Real Master Mix（SYBR Green Ⅰ）說明書。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 5min；95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 20s，40個循環(huán)。按照2-ΔΔCT法計算出基因表達水平的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取及檢測

取4μL甘蔗葉片總RNA經(jīng)1.0％凝膠瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖1結(jié)果表明RNA帶型完整清晰，18S和28S兩條帶比較完整且較亮，5S則隱約可見，并無雜質(zhì)污染，說明所提取的甘蔗RNA質(zhì)量較好。紫外分光光度計測定，RNA的OD260/OD280值在1.85-1.95之間，OD260/OD230值在2.0-2.2之間，說明提取的總RNA 完整度和純度都較高，可進行后續(xù)試驗。

圖1 甘蔗葉片總RNA瓊脂糖檢測

2.2 SoASR 基因全長cDNA克隆

以混合甘蔗葉片cDNA為模板，用簡并引物ASR引物和3 side通用引物進行PCR擴增，擴增得到一條750bp左右的片段（圖2），經(jīng)過回收、克隆和測序后在NCBI進行比對，結(jié)果為甘蔗ASR基因cDNA全長。其cDNA全長序列為753bp，包含啟始密碼子ATG和終止密碼子TAA，命名為SoASR，GenBank登錄號為JX470187。該基因cDNA序列包含一個429bp的ORF，編碼142個氨基酸，另外包含324bp的3'非編碼區(qū)，3'非編碼區(qū)還包括一個18bp ploy（A）尾巴。

2.3 SoASR基因生物信息學(xué)分析

圖2 甘蔗SoASR基因PCR擴增結(jié)果

生物信息學(xué)分析顯示，SoASR蛋白分子量大小為25.9kD，等電點為6.1。Glu、Ala的出現(xiàn)頻率較高，分別為19.0％和14.1％；Met、Arg頻率較低，為0.07％。亞細胞定位顯示其主要位于細胞核。該基因氨基酸序列不含信號肽，是一類可溶性蛋白，沒有跨膜區(qū)域；疏水性最小值為-5.7，最大值為4.5；該基因氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)糖基化位點，含有1個Ser、2個Thr和3個Tyr磷酸化位點。該基因二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示：含有81個α-螺旋，占57.04％；隨機卷曲31個，占21.83％；延伸鏈15個，占10.56％；β-轉(zhuǎn)角15個，占10.56％。該基因氨基酸序列功能結(jié)構(gòu)域分析表明，40-43、46-49兩個為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，72-77、2-32兩個為N-肉豆蔻酰化位點，6-13為富含組氨酸結(jié)構(gòu)域，53-132為脫落酸/WDS誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)域（圖3）。

圖3 SoASR基因編碼區(qū)核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列

用MEGA 4.0軟件構(gòu)建了甘蔗SoASR基因與其它12個物種氨基酸序列的進化樹。結(jié)果（圖4）表明，13個不同物種ASR基因被聚為4個組，草莓和鹽角草為一組，水稻單獨為一組，銀杏和云杉為一組，其余為一組，而甘蔗SoASR與大蕉、玉米和高粱聚為一小組，同源性為79％、93％和88％，說明甘蔗和玉米、高粱等的親緣關(guān)系較近。

圖4 甘蔗SoASR基因與其它物種ASR基因的氨基酸序列同源性分析

2.4 SoASR基因原核表達載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達

大量提取pMD18T-SoASR和pET-30a（+）質(zhì)粒并進行純化，利用EcoRⅠ+Hind Ⅲ分別進行雙酶切，回收插入目的片段和表達載體，按DNA Ligation連接試劑盒說明進行連接，獲得重組質(zhì)粒pET30a-SoASR。以重組表達質(zhì)粒pET30a-SoASR 為模板，PCR擴增出429bp 左右的片段，并將重組質(zhì)粒陽性克隆測序，結(jié)果（圖5- A）表明插入片段與克隆序列完全一致，ORF 正確。在此基礎(chǔ)上，又用EcoRⅠ+Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒pET30a-SoASR，可切得約5 460bp的pET-30a（+）載體片段和429bp 左右SoASR基因片段（圖5- B），表明SoASR 基因已插入載體質(zhì)粒中，SoASR基因的原核表達載體pMD18TSoASR構(gòu)建成功。

將鑒定后的pET30a-SoASR和空載體pET-30a（+）轉(zhuǎn)入表達菌BL21（DE3）中，用1mmol/L和2mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖6。在2 個不同濃度和不同時間的IPTG 誘導(dǎo)下，均能誘導(dǎo)出融合蛋白，而對照則沒有融合蛋白表達。在分子量約為32.0kD的位置上存在1 條融合蛋白誘導(dǎo)表達的條帶，與SoASR編碼蛋白分子量理論值基本相符，表明原核表達載體構(gòu)建正確。

圖5 重組質(zhì)粒pET30a-SoASR PCR和雙酶切驗證結(jié)果

圖6 SoASR在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE電泳圖譜

2.5 SoASR基因在低溫脅迫和ABA處理下的表達分析

由圖7可知，低溫脅迫下，SoASR基因在未噴ABA處理的兩個甘蔗品種中表達趨勢不同，在GT28L中其表達趨勢為先升后降，在脅迫1d時達到最大，分別為脅迫0、7和14d的7.4倍、4.6倍和11.2倍；在YL6L中其表達呈下降趨勢，并在脅迫14d時降到最低，為0d的13.5％。加ABA處理的兩個甘蔗品種SoASR基因的表達都呈下降趨勢，在脅迫14d時降到最低，分別為未進行低溫處理前的13.5％和2.8％，相比之下，YL6LA的降幅要大于GT28。外噴ABA后，SoASR基因的表達明顯被誘導(dǎo)，在脅迫0d時，GT28LA為GT28L的9.6倍，YL6LA為YL6L的2.9倍。

圖7 兩個甘蔗品種SoASR基因在低溫脅迫和ABA處理下的表達

3 討論

脫落酸（ABA）作為一種重要的植物應(yīng)答逆境脅迫的調(diào)節(jié)因子，在植物抵御如低溫等不良脅迫反應(yīng)中起著重要的作用。雖然目前大量研究證實ABA途徑及ABA誘導(dǎo)合成的關(guān)鍵基因受各類脅迫的影響，但ABA響應(yīng)低溫脅迫的應(yīng)答機制還不清楚。克隆甘蔗ASR蛋白，可為進一步研究ABA在甘蔗抗逆脅迫中的作用提供理論基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗SoASR基因雖與玉米、水稻的同源性較高但與其它物種的同源性較低，說明ASR基因在進化過程中變異較大。同時，SoASR基因氨基酸序列不含信號肽，也未有跨膜區(qū)域和糖基化位點；亞細胞定位確定其位于細胞核。有研究表明植物大約1/3 ASR定位于細胞核，其它大多數(shù)分散在細胞質(zhì)中；而ASR作用主要在細胞核中，并通過核定位信號參與多個核質(zhì)運輸途徑［12］。但現(xiàn)有研究證明，ABA參與逆境脅迫時作為信號分子功能通過ABA受體將其運到效應(yīng)部位，進而誘導(dǎo)植物提高抗逆性［12，20］，因此，推測ASR基因是通過其氨基酸序列中的磷酸化位點，即酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點進行蛋白磷酸化來介導(dǎo)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的，使蛋白激酶總活性增加來減少活性氧的生成，起到抗氧化防護作用［21］。通過對SoASR基因在低溫脅迫和ABA處理下表達的研究，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下SoASR基因在抗寒性強品種GT28中上調(diào)表達，并在脅迫1d迅速達到峰值，而在抗寒性弱的品種YL6中卻一直表現(xiàn)為下調(diào)表達。推測SoASR基因可能在甘蔗抗寒過程中發(fā)揮了信號傳導(dǎo)作用，進而能將更多的信號傳送出去，通過蛋白質(zhì)磷酸化參與ABA誘導(dǎo)下游基因表達，從而起到保護作用［22，23］；而在YL6中表達的下調(diào)，也就阻礙了其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和下游基因的表達調(diào)控，從而表現(xiàn)出低抗寒力。外噴ABA處理后，SoASR基因在兩個甘蔗品種中的表達都明顯上調(diào)，這樣可加強ASR基因通過磷酸化和去磷酸化來介導(dǎo)ABA信號傳導(dǎo)途徑，提高甘蔗自身抗氧化防護的能力。這在草莓上也有相似的報道［24］。由此可見，SoASR基因與甘蔗的抗寒性密切相關(guān)，下一步將通過抗體制備和轉(zhuǎn)基因等方面的研究，進一步探討SoASR基因在甘蔗低溫脅迫中的作用機制。

4 結(jié)論

采用同源克隆和RT-PCR技術(shù)克隆了甘蔗SoASR 基因全長429bp的完整編碼序列，GenBank登錄號為JX470187，編碼142個氨基酸的蛋白。原核表達結(jié)果表明該基因以融合蛋白形式表達，相對分子量約為32.0kD。結(jié)果表明，低溫脅迫下該基因在抗寒性不同的品種中表達特性不同，但在抗寒性不同的品種中該基因的表達都受ABA的誘導(dǎo)，推測SoASR 基因在甘蔗抗寒機制中發(fā)揮某種作用。

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