辛桂瑜 王麗霞 葉新慧 申魁魁 符欣蕙 李恭賀 張明，2盧晟盛，2 盧克煥，2 鄭喜邦

Klf4（Krüpple like factor 4，Krüpple 樣 因 子 4）是一類含3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的雙向轉(zhuǎn)錄因子。長期以來，由于Klf4在細(xì)胞增殖、分化、生長特別是與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系而備受關(guān)注。Klf4可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的自我更新［1］；Sikora 與 Ghosh［2，3］的研究還表明，Klf4具有促進(jìn)表皮的增殖分化以及抑制膀胱癌等惡性腫瘤發(fā)生等多種功能。Klf4在許多類型的腫瘤中特異性過表達(dá)或者缺失，例如，在結(jié)腸癌、小腸癌、膀胱癌、前列腺癌和食道癌等腫瘤中Klf4低表達(dá)［4-8］，胃癌中Klf4有雜合性缺失的表現(xiàn)［9］，而在原發(fā)性乳腺導(dǎo)管癌以及口腔鱗癌中Klf4高表達(dá)［10，11］。近年來對(duì)干細(xì)胞的相關(guān)研究表明，Klf4等因子參與體細(xì)胞重編程，并發(fā)揮重要作用［12］。Takahashi 等［13］將 Klf4、 Sox2、Oct4、c-Myc 四 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞中，獲得了iPS細(xì)胞（induced pluripotent stem cells），這一突破為患者自身遺傳特性的ES細(xì)胞獲取提供了新的途徑，也為臨床治療提供了新的研究方向。此后，Takahashi 等［14］用同樣的方法獲得了人類iPS 細(xì)胞 。 Hanna 等［15］利用人類鐮狀細(xì)胞性貧血的小鼠動(dòng)物模型，對(duì)其導(dǎo)入Klf4、Sox2、Oct4及c-Myc基因，將小鼠皮膚成纖維細(xì)胞重編程為自體iPS細(xì)胞，并對(duì)iPS細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，從而得到造血功能正常的前體細(xì)胞，進(jìn)而起到了治療作用。迄今為止，已相繼獲得了獼猴、豬、大鼠和綿羊等物種的iPS細(xì)胞［16-19］，但是尚未見有關(guān)山羊體細(xì)胞重編程的報(bào)道。王春生等［20］、楊越飛等［21］對(duì)小鼠和綿羊Klf4基因分別進(jìn)行了原核及真核表達(dá)的研究，但山羊Klf4基因的研究未見報(bào)道。

本研究旨在克隆山羊Klf4基因，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，純化His-Klf4融合蛋白，從而為其多克隆抗體制備奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究山羊多能干細(xì)胞創(chuàng)造良好條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α，質(zhì)粒pET-30a由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 TRIzol LS?Regent RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司（美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ、pMD18-T載體、IPTG，膠回收試劑盒均購自寶生物工程有限公司（大連）；蛋白預(yù)染Marker購自Fermentas公司（立陶宛）；DNA Marker 2000購自百維信生物科技有限公司（廈門）；EB替代染料（GeneFinder核酸染料），購自康為公司（北京）；質(zhì)粒小量提取試劑盒，購自O(shè)mega Bio-Tek公司（美國）；鼠源His標(biāo)簽抗體、山羊抗鼠IgG購自TIANGEN公司（北京）。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的克隆與測序 根據(jù)GenBank中牛Klf4mRNA序列（NM.001105385.1）設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在引物5'端分別引入EcoR I和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。引物由Invitrogen公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為1 434bp。從山羊生殖脊提取總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25μL PCR 反應(yīng)體系為 ：2×GC Buffer I 12.5μL，dNTPmix 2.5μL，上下游引物各0.5μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.15μL， 模 板 cDNA0.75μL， 加 雙 蒸 水 7.25μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，61.6℃退火 90s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳、切膠后，用膠回收試劑盒純化。目的片段與pMD18-T載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，涂板。挑斑、增菌、小提質(zhì)粒，分別用EcoR I和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送寶生物工程有限公司測序。

1.2.2 信號(hào)肽預(yù)測 用DNAStar軟件比較山羊與綿羊、牛、中國水牛、野豬Klf4核苷酸序列同源性；借助SignalP4.0在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測Klf4編碼蛋白是否存在信號(hào)肽。

1.2.3 山羊Klf4原核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定 選擇測序正確的pMD18-T-Klf4陽性質(zhì)粒，用EcoRI和HindⅢ分別將pMD18-T-Klf4與表達(dá)載體pET-30a進(jìn)行雙酶切，膠回收Klf4目的片段和線性化的pET-30a載體，用T4DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑斑、增菌、小提質(zhì)粒和雙酶切鑒定。陽性質(zhì)粒送寶生物工程有限公司測序。

1.2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 經(jīng)鑒定與測序，將閱讀框正確的重組質(zhì)粒pET30a-Klf4轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂板、挑斑并加入含氨芐青霉素（終濃度100μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，取重組菌按1∶100體積比轉(zhuǎn)接入含氨芐青霉素的5mL LB 培養(yǎng)基中，220r/min，37℃ 振蕩培養(yǎng)至 OD600nm=0.4-0.6時(shí)，加入終濃度為1mol/L 的 IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。收集2mL菌液以12000r/min離心4min，沉淀用80μL PBS（pH7.4）懸浮，加入 5×SDS-Loading Buffer 20μL，混勻后置冰上10min，煮沸10min，12000r/min離心5min，取10μL上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色確定目的蛋白是否表達(dá)。

1.2.5 融合蛋白Western blotting檢測 取上述蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。以濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)到NC（硝酸纖維素）膜上，用TBST配制的5％脫脂奶粉室溫封閉2-3h。加入鼠源His標(biāo)簽抗體（1∶2000）4℃孵育過夜后用TBST漂洗3次，每次10min。加入山羊抗鼠IgG（1∶2000），室溫孵育1-1.5h，用TBST 漂洗3次，每次10min。洗膜后用化學(xué)發(fā)光劑A、B各250μL滴至保鮮膜上混勻，將NC膜的蛋白面朝下，覆蓋在顯色劑上作用5min，吸取多余的顯色劑，NC膜蛋白面朝上，包裹后固定在暗盒內(nèi)，壓X光膠片，曝光。經(jīng)顯影、定影，用預(yù)染蛋白Marker判定目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.6 融合蛋白的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)成功的重組菌液按1∶100比例轉(zhuǎn)接5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜。活化的菌液按1∶200比例轉(zhuǎn)接500mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入IPTG，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)4h。以5000r/min 4℃離心8min，收集菌體沉淀并稱重。隨后的蛋白純化按照 Ni-NTA argrose使用說明進(jìn)行。每1g濕重沉淀加5mL的Buffer B 制成懸浮液；置于室溫下180r/min搖床振搖1h后超聲波破碎10min，以12000r/min 4℃離心20min，取其上清，用0.45μm濾器過濾后緩慢加入含Ni-NTA argrose的純化柱中，室溫下慢速搖動(dòng)混勻2h，靜置后過柱；用2倍柱床體積Buffer C洗滌3次，用2倍柱床體積 Buffer E洗脫His-Klf4融合蛋白。分別收集少量裂解液上清、沉淀、過柱液、Buffer C和Buffer E洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析。純化的蛋白冷凍干燥保存于-80℃冰箱待用。

2 結(jié)果

2.1 PCR電泳檢測

提取的山羊生殖脊總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。在紫外燈下觀察，可發(fā)現(xiàn)在約1500bp處有一特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 山羊Klf4 RT-PCR產(chǎn)物凝膠圖

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-Klf4的酶切鑒定與測序

將重組質(zhì)粒pMD18-T-Klf4用EcoR I和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切以及1％瓊脂糖凝膠電泳，得到約1500bp目的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果表明Klf4基因的閱讀框由1 434 個(gè)核苷酸組成，共編碼478個(gè)氨基酸（圖3）。用DNAStar軟件將該基因核苷酸序列分別與綿羊、牛、中國水牛、野豬Klf4進(jìn)行核苷酸序列同源性比較，結(jié)果（表1）分別為98.5％、98.2％、98.0％和 94.2％。 經(jīng) 過 SignalP 4.0在線分析，山羊Klf4編碼蛋白不存在信號(hào)肽（圖4），全長序列可用于原核表達(dá)。

圖2 山羊pMD18-T-Klf4雙酶切鑒定

圖3 山羊Klf4基因的測序結(jié)果

表1 山羊Klf4基因核苷酸序列與其他物種的Klf4序列同源性比較（％）

圖4 山羊Klf4基因信號(hào)肽分析

2.3 重組質(zhì)粒pET30a- Klf4的酶切鑒定

將原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Klf4進(jìn)行EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切以及1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到目的片段約為1500bp（圖5），與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)果表明pET30a-Klf4重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒pET30a-Klf4酶切鑒定

2.4 pET30a-Klf4在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與His-Klf4融合蛋純化

SDS-PAG電泳表明，重組質(zhì)粒pET30a-Klf4在大腸桿菌BL21中得到表達(dá)，表達(dá)的His-Klf4融合蛋白分子量約為52kD（圖6），與理論值相符。免疫印跡檢測結(jié)果（圖7）也與SDS-PAGE電泳結(jié)果相一致，在分子量約52kD 處有特異性條帶，說明目的蛋白確實(shí)為His-Klf4融合蛋白，融合基因閱讀框正確。在變性條件下，用鎳離子金屬螯合親和層析法純化His-Klf4融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析（圖8），純化產(chǎn)物呈單一條帶，與上述預(yù)期結(jié)果一致，證明獲得了His-Klf4融合蛋白。

圖6 pET30a-Klf4表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

圖8 His-Klf4純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析

3 討論

獲得純化的Klf4轉(zhuǎn)錄因子蛋白，必須要建立最佳的原核表達(dá)體系，而表達(dá)載體的選擇又是關(guān)鍵的因素之一。在本研究中，我們之前選用pRSET-A作為表達(dá)載體，但最終獲得的重組蛋白表達(dá)量不高，改用pET-30a后，獲得了表達(dá)效率較高的重組蛋白。這是因?yàn)閜ET-30a具有功能強(qiáng)大的T7啟動(dòng)子，而T7 RNA聚合酶具有較高的選擇性與活性，大多數(shù)的細(xì)胞資源在誘導(dǎo)充分時(shí)都可被用于目的基因的表達(dá)，因此可以獲得高效表達(dá)的重組蛋白［22，23］。另外，pET-30a載體含有的6×His Tag可作為純化的標(biāo)志，His融合蛋白經(jīng)過Ni-NTA argrose層析柱可以進(jìn)一步純化。

圖7 融合蛋白His-Klf4的Western blotting檢測

本研究構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-Klf4在宿主菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)。本研究表明，1mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)4h，表達(dá)效果較好。經(jīng)可溶性分析，目的蛋白以包涵體的形式存在，用8mol/L尿素在變性條件下進(jìn)行純化，結(jié)果比較滿意。但在進(jìn)行His-Klf4融合蛋白的純化過程中，目的蛋白與鎳離子親和層析柱結(jié)合不穩(wěn)定。針對(duì)此種情況，改變了多種條件，最終發(fā)現(xiàn)在裂解液中加入10％甘油并把pH調(diào)至7.4后蛋白能與鎳離子親和層析柱較好地結(jié)合，這是由于菌液進(jìn)行超聲裂解之后pH有所下降，當(dāng)pH在4.5-5.3時(shí)組氨酸殘基質(zhì)子化，蛋白無法與鎳離子進(jìn)行結(jié)合。在目的蛋白的洗脫過程中，目的蛋白洗脫量過低，洗脫液中含有大量雜蛋白。在裂解液中加入吐溫、Triton等表面活性劑，減少了雜蛋白與層析柱的非特異性結(jié)合，并且根據(jù)目的蛋白等電點(diǎn)（pH8.0）改變雜蛋白洗脫液pH值，最終用pH值5.0的洗脫液洗脫目的蛋白，獲得了較好的純化效果。

總之，本研究克隆了山羊Klf4基因，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體，通過誘導(dǎo)表達(dá)和純化獲得了山羊His-Klf4的融合蛋白，為山羊多能干細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用RT-PCR方法從山羊原始生殖嵴中成功克隆了Klf4基因，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Klf4，通過原核表達(dá)技術(shù)成功獲得了純化的山羊His-Klf4融合蛋白。

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