應(yīng)長江 林紅曉 李 偉 (徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 徐州 221002)

在我國，糖尿病腎病(DN)是導(dǎo)致終末期腎衰竭(ESDR)的第二位疾病〔1，2〕。在遺傳因素與長期高血糖等環(huán)境因素相互作用下，腎小球血流量、腎小球濾過率及壓力增加，腎組織缺血、缺氧，細胞因子，多元醇途徑活化及氧化應(yīng)激等異常長期存在導(dǎo)致腎小球、腎小管和間質(zhì)細胞合成細胞外基質(zhì)蛋白(ECM)增多，腎小球基底膜(GBM)增厚和以腎小球系膜區(qū)為主的ECM積累，導(dǎo)致彌漫性和結(jié)節(jié)性腎小球硬化，出現(xiàn)蛋白尿及腎功能不全等表現(xiàn)〔3〕。實驗證實:轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達增加在DN發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，抑制腎組織中 TGF-β1、VEGF表達能夠延緩 DN的進程〔4，5〕。血管抑素(AS)能夠抑制腫瘤生長、新生血管形成、降低血管通透性〔6，7〕，治療糖尿病視網(wǎng)膜病變，抑制病變血管通透性、保護血管內(nèi)皮細胞、降低局部VEGF、增加色素上皮衍生因子(PEDF)、MMP 表達〔8，9〕。研究發(fā)現(xiàn)，AS 能夠降低 DN 大鼠的蛋白尿。重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)血管抑素基因(rAAV-AS)由于其宿主范圍廣，免疫原性低，表達攜帶基因長久等，被廣泛用于基因治療的研究。本實驗旨在探討rAAV-AS對DN大鼠腎皮質(zhì)中TGF-β1、VEGF表達的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 雄性SD大鼠，體重160～180 g，8周齡，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。在徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)，室溫控制在20℃ ～25℃，相對濕度62% ～80%，通風(fēng)干燥、安靜，12 h光照周期，自由攝食飲水，保持墊料干燥;所需大鼠飼料購自徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，rAAV-AS由本元正陽公司構(gòu)建。尿白蛋白放免試劑盒購自北京福瑞生物工程公司。

1.2 實驗分組和模型制備 40只清潔級雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料1 w后，從中隨機抽取10只作為正常對照組(NC組)，其余造模為糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射STZ 60 mg/kg，NC組僅注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后尾靜脈測血糖大于16.7 mmol/L認為造模成功，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，把糖尿病大鼠隨機分為DN組(n=10)，重組腺相關(guān)病毒空載體組(rAAV-0，n=10)，rAAV-AS治療組(AS組，n=10，2×1012VG/kg)。大鼠尾靜脈分別注射rAAV-AS或同等劑量的生理鹽水，rAAV-0組注射同等劑量rAAV-0空載體;從第2周起，整個實驗過程共持續(xù)8 w。

1.3 標(biāo)本收集 各組大鼠于8 w末測量體重，尾靜脈取血測定血糖，用代謝籠收集24 h尿液、離心，保存于－40℃冰箱中，以待測尿白蛋白。大鼠隔夜空腹，1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg腹腔注射)麻醉下心臟采血、離心、取上清，－40℃冰箱保存，以備測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。然后，取大鼠雙腎，留取行免疫印跡法檢測。

1.4 生化指標(biāo)檢測 膠體金雙抗體夾心法檢測MAU，葡萄糖氧化酶法檢測血糖，分析法檢測HbA1c。

1.5 免疫組化染色 4 μm厚石蠟切片脫蠟、抗原修復(fù)，3%H2O2孵育，分別滴加兔抗大鼠TGF-β1和VEGF(1∶50)多克隆抗體，復(fù)溫30 min;PBS沖洗，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加新鮮配制的DAB溶液，蘇木素復(fù)染，水洗;1%鹽酸酒精分化，水洗;碳酸鋰藍化，脫水、透明、中性樹膠封固。結(jié)果:陽性反應(yīng)為棕黃色或黃褐色顆粒沉積。將免疫組化切片圖像通過圖像采集系統(tǒng)(高倍鏡，×400)，每張標(biāo)本按順序選5個腎小球，采用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件測定每個視野中免疫組化陽性表達的IOD累積光密度。

1.6 免疫印跡法

1.6.1 胞漿和胞核蛋白提取液制備 剪取的腎組織，加入Buffer A，勻漿器3 000 r/min勻15次，離心15 min得上清及沉淀。上清離心15 min后所得上清即為胞漿蛋白提取液。沉淀加Buffer A，離心15 min洗一次，棄去上清，取沉淀加buffer B，DNA混合器4℃搖勻0.5 h，離心15 min，取上清即為胞核蛋白提取液。

1.6.2 蛋白濃度的測定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6.3 蛋白免疫印跡法 測定抗血管生成抑制因子抗體、βcatin的蛋白表達量及其活性的變化。將已制備的細胞胞漿或胞核蛋白提取液各取10 μl測其蛋白濃度后，將各樣品用勻漿液稀釋至相同濃度，加入1/3體積的4倍蛋白變性液95℃～100℃水浴變性5 min;取等量蛋白樣品(50～100 μg)加入10%SDS-PAGE分離后，以濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至NC膜上，加入3%封閉液，室溫封閉3 h;加入一抗(p-AS 1∶200)，4℃過夜，WB洗膜6 min×3次;分別加入相應(yīng)的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，WB洗膜6 min×3次;加入顯色劑(NBT/NCIP顯色試劑盒)，反應(yīng)達到要求后流水洗滌終止反應(yīng)。所得顯色條帶經(jīng)圖像處理儀行激光掃描、定量分析及打印。對照實驗以雙蒸水代替一抗，其余操作相同。上述因子的蛋白激活水平分別以其免疫反應(yīng)活性，即免疫印跡中相應(yīng)區(qū)帶的光密度(OD)值相對于對照組的倍數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實驗中5只大鼠可能因血糖過高死亡。實驗結(jié)束時共存活大鼠35只，其中 NC組10只，DN組8只，rAAV-0組9只，AS組8只。NC組大鼠精神較好，毛發(fā)光澤，體重增加，行動敏捷，食欲好，每天添加1次食物，每周換1次墊料，墊料無異味;DN組大鼠血糖明顯升高并出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦等典型“三多一少”的糖尿病表現(xiàn)，精神萎靡，毛色晦暗無光澤，體重減輕，行動遲緩，食欲差，易死亡;rAAV-0組和DN組大鼠表現(xiàn)類似;AS組大鼠精神一般，毛發(fā)無明顯晦暗，體重增加，行動可，食欲好，每2天添加1次食物，每周換2次墊料。

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)變化 與NC組比，DN、rAAV-0、AS組BG、HbA1c、MAU明顯增高(P ＜0.05);與DN組相比，AS組MAU明顯降低(P＜0.05);與rAAV-0組相比，AS組MAU明顯降低(P＜0.05)。見表1。

2.3 免疫印跡法測腎組織中AS表達情況 與NC組(0.78±0.26)比較，DN組和 rAAV-0組表達 AS較少(0.12±0.28，0.12±0.29，P＜0.05);與DN組相比，AS組大鼠腎組織中AS表達明顯增多(0.51±0.52，P＜0.05);與rAAV-0組相比，AS組大鼠腎組織中AS表達明顯增多(P＜0.05)。見圖1。

2.4 光鏡 HE染色:NC組大鼠腎小管、小管間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)清楚，腎小球細胞數(shù)目正常，毛細血管腔均勻一致，無狹窄，腎小管上皮細胞大小一致，排列整齊;基底膜完整，間質(zhì)中未見炎癥細胞和纖維組織增生。與NC組大鼠相比，DN組病變較明顯:腎小球細胞數(shù)顯著增多，毛細血管袢塌陷，管腔閉塞，腎小球明顯體積增大，腎小球基底膜增厚、腎小球系膜基質(zhì)增生、淋巴細胞數(shù)量增多，出現(xiàn)玻璃樣變;腎小管尤其是近曲小管腫脹、變性、空泡形成，腎間質(zhì)可見大量淋巴細胞和單核巨噬細胞浸潤。rAAV-0組較DN組未見改善，AS組上述病變較DN組有改善，可見腎小球細胞數(shù)教多，毛細血管腔輕度狹窄，腎小管-間質(zhì)見少量淋巴細胞浸潤。見圖2。

2.5 免疫組化結(jié)果 與NC組比較，DN組、rAAV-0組TGF-β1和VEGF表達明顯增加，呈強陽性(P＜0.05);與DN組比較，AS組TGF-β1和VEGF表達明顯降低(P＜0.05);與rAAV-0組比較，AS組TGF-β1和VEGF表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0.05)。見表2，圖3，圖4。

表1 rAAV-AS對DN大鼠生化指標(biāo)的影響(±s)

表1 rAAV-AS對DN大鼠生化指標(biāo)的影響(±s)

與NC組比較:1)P＜0.05;與DN組比較:2)P＜0.05;與rAAV-0組比較:3)P ＜0.05，下表同

組別 n BG(mmol/L) HbA1c(%) MAU(μg/24 h)10 6.54±1.51 6.77±1.10 9.20±1.87 DN組 8 22.30±2.091) 14.29±1.781) 107.75±2.781)rAAV-0組 9 21.91±1.341) 13.74±3.201) 103.59±3.711)AS組 8 23.17±1.341) 14.83±3.201)80.46±3.711)2)3)NC組

圖1 各組AS免疫印跡表達

圖2 各組大鼠腎臟組織學(xué)形態(tài)(HE，×400)

圖3 各組大鼠腎臟組織(DAB，×40)

圖4 各組大鼠腎臟組織(DAB，×400)

表2 各組大鼠腎臟組織TGF-β1和VEGF表達(±s)

表2 各組大鼠腎臟組織TGF-β1和VEGF表達(±s)

組別 n TGF-β1VEGF NC組10 8.89±1.61 7.54±0.85 DN組 8 83.95±4.721) 79.30±3.781)rAAV-0組 9 81.09±4.891) 73.91±4.781)AS組 8 34.30±2.711)2)3) 36.30±1.131)2)3)

3 討論

DN表現(xiàn)為腎臟肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚、細胞外基質(zhì)積聚致系膜區(qū)擴張，最后導(dǎo)致腎小球纖維化、硬化。研究表明DN早期TGF-β1通過受體信號傳遞(通過Smad基因)調(diào)節(jié)細胞增殖和分化，并抑制近曲小管上皮細胞、腎小球上皮細胞和腎小球內(nèi)皮細胞的增殖分化TGF-β1能阻止腎小管上皮細胞從G1期過渡到S期，使RNA蛋白質(zhì)合成增加，導(dǎo)致ECM增厚引起微量蛋白尿。足細胞受VEGF刺激分泌一些物質(zhì)能增加腎小球毛細血管的大分子通透性，內(nèi)皮細胞受VEGF刺激后膠原酶合成增加，分解GBM蛋白，從而破壞腎小球濾過膜，引起蛋白尿。VEGF在增加內(nèi)皮細胞通透性使大量血漿蛋白漏出的同時伴纖維蛋白及一些黏附分子的漏出。上述物質(zhì)可在血管周圍形成一層細胞外基質(zhì)，為隨后細胞外基質(zhì)的形成和堆積提供了良好的條件。在此基礎(chǔ)上，GBM增厚，系膜病變加重，出現(xiàn)大量蛋白尿，最終發(fā)展成為腎小球硬化〔6，7，10〕。

1994 年，首次從Lewis肺癌小鼠血清和尿液中分離出AS，并發(fā)現(xiàn)AS是一種能夠特異性抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞增生的因子，是大分子物質(zhì)纖溶酶原的一個片段，目前國內(nèi)外研究AS對DN的作用很少。AS基因注射宿主，轉(zhuǎn)染效率低、安全性差而且費用高昂，AAV是一種無包膜的人單鏈DNA病毒，重組AAV由于其宿主范圍廣，免疫原性低，表達攜帶基因長久等優(yōu)點而越來越多地被用于基因治療的實驗研究。

本實驗表明:腺相關(guān)病毒空載體沒有對DN腎臟起保護作用，只是起載體作用;腺相關(guān)病毒介導(dǎo)血管抑素對DN腎臟有保護作用，而且不依賴血糖降低，可通過降低TGF-β和 VEGF表達而起作用。

綜上，rAAV-AS對DN早期起保護作用，且這種保護作用可能通過降低TGF-β1和VEGF的表達有關(guān)，rAAV-AS對DN的保護作用的具體機制我們將在今后的實驗中繼續(xù)探討。

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