白美玲 李玉珍 金春亭

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北 張家口 075000)

食管癌就診時(shí)多為中晚期患者，臨床上一般采取手術(shù)結(jié)合化療。而常規(guī)的藥物治療副作用大，效果欠佳，故新的抗癌藥物的研發(fā)迫在眉睫。近年來一些學(xué)者嘗試從植物中提取有效成分成為尋找抗癌藥物的新途徑。魚藤素是魚藤屬植物及灰葉屬植物中提取的一種黃酮類化合物，具有抗病毒、抗腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)采用多種方法與手段通過體外觀察魚藤素對食管癌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試劑 人食管癌細(xì)胞株Ec-109購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心凍存保留。魚藤素購自ALEXIS公司，純度為95.6%，用DMSO溶解配成10 mmol/L的儲存液，等量分裝，－20℃保存，使用前用RPMI1640稀釋。RPMI1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清(FCS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司。Annexin V/PI雙染試劑盒為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Ec-109細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將人食管癌細(xì)胞株Ec-109細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在含有5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)生長期后，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，將實(shí)驗(yàn)分為5組:對照組(加入等量培養(yǎng)液)及5、10、20 和40 nmol/L魚藤素組。

1.2.2 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 將不同濃度魚藤素藥物組及對照組作用24 h的Ec-109細(xì)胞懸液少許滴在干凈的載玻片上，通過熒光顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3 Annexin-V FITC/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡 收集不同濃度藥物組及對照組作用24 h的Ec-109細(xì)胞，每組計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞，離心，棄去上清液，用PBS緩沖液洗滌兩遍，再按照流式試劑盒的說明向細(xì)胞中分別加入185μl緩沖液，5μl Annexin V和10μl PI，混勻避光20 min，離心后棄去上清，再加入冷PBS洗滌一次，用500μl PBS緩沖液懸起細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡檢測。

1.2.4 線粒體跨膜電位的檢測 將魚藤素作用24 h的Ec-109細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，離心，棄去培養(yǎng)基;再用無血清的培養(yǎng)基洗滌Ec-109細(xì)胞兩遍，離心，懸浮Ec-109細(xì)胞，標(biāo)記羅丹明123(Rho 123)，使其終濃度為10μg/ml，混勻;在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min;PBS緩沖液洗滌兩遍，棄去上清;上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.5 免疫組化法檢測Bcl-2蛋白與Bax蛋白的表達(dá) 常規(guī)免疫組化染色法，將5、10、20與40 nmol/L魚藤素組分別作用于Ec-109細(xì)胞24 h后，觀察Bcl-2蛋白與Bax蛋白表達(dá)情況，并與未加魚藤素的對照組進(jìn)行對比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較行q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察EC-109細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 對照組細(xì)胞大小一致，細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光，實(shí)驗(yàn)組可見細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞核固縮，染色質(zhì)邊集，核碎裂，染色質(zhì)分割成塊，細(xì)胞核呈致密濃染的顆粒狀熒光和形成凋亡小體等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)改變(圖1)。

2.2 魚藤素對食管癌Ec-109細(xì)胞凋亡的影響 魚藤素處理Ec-109細(xì)胞24 h后，用Annexin V-FITC和PI雙染法對Ec-109細(xì)胞標(biāo)記后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示魚藤素對食管癌Ec-109細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞死亡作用，5、10、20和40 nmol/L魚藤素用藥組細(xì)胞早期凋亡率分別為(4.37±0.35)%、(6.71±0.14)%、(15.62±0.21)% 和(19.78±0.15)%，與對照組自發(fā)早期凋亡率(1.10±0.08)%相比均有顯著差異(P＜0.05)，并隨魚藤素濃度的升高，凋亡率也相應(yīng)增高，呈正相關(guān)。

2.3 魚藤素對食管癌Ec-109細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示對照組Ec-109細(xì)胞的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，給予5 nmol/L魚藤素作用24 h后，出現(xiàn)了一個(gè)明顯的未被羅丹明123染色的峰，隨著魚藤素濃度的增加，弱熒光部分Ec-109細(xì)胞含量逐漸增多，細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸減弱，熒光像素向左移動逐漸增多，說明細(xì)胞的線粒體跨膜電位逐漸降低，細(xì)胞凋亡或壞死的數(shù)量也增加。若把對照組熒光強(qiáng)度看作100%，5、10、20與40 nmol/L魚藤素組熒光指數(shù)分別為(93.40±0.70)%、(80.29±0.66)%、(71.15±0.59)%、(63.51±0.53)%。5 nmol/L魚藤素組與對照組差異不明顯(P＞0.05)，而10、20與40 nmol/L魚藤素組較對照組相明顯下降(P＜0.05)。

2.4 Bcl-2蛋白、Bax蛋白在食管癌Ec-109細(xì)胞中表達(dá)的免疫組化結(jié)果 Bcl-2蛋白與Bax蛋白表達(dá)陽性均表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)灶性或彌漫分布的棕黃色顆粒，我們以陽性細(xì)胞的數(shù)量和顏色綜合判斷兩種蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)對照組Bcl-2蛋白與Bax蛋白表達(dá)均高，魚藤素組Bcl-2蛋白表達(dá)量隨著藥物濃度的升高而降低，而Bax蛋白隨著用藥濃度的升高而增高。

圖1 對照組與實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞形態(tài)(×400)

圖2 40 nmol/L魚藤素用藥組Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表達(dá)情況(DAB，×400)

3 討論

現(xiàn)在普遍認(rèn)為〔1〕，大多數(shù)抗腫瘤藥物都可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的形式殺滅腫瘤細(xì)胞從而達(dá)到良好的治療效果，有報(bào)道提示〔2，3〕魚藤素對非小細(xì)胞肺癌有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，而對正常人體細(xì)胞沒有殺傷作用。為探討魚藤素對食管癌Ec-109細(xì)胞的凋亡作用，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥物濃度與作用時(shí)間呈劑量-時(shí)間依賴關(guān)系，這與文獻(xiàn)報(bào)道的藥物濃度范圍一致〔4〕。

近年來體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)〔5〕，線粒體是處于調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡的中心位置，機(jī)體有多種信號途徑可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但所有這些途徑都可能集中于細(xì)胞的線粒體。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著魚藤素濃度的增高，Ec-109細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明Ec-109細(xì)胞的線粒體跨膜電位(△Ψm)逐漸降低，細(xì)胞凋亡或壞死漸多。我們推斷是由于魚藤素導(dǎo)致線粒體膜電位損傷，使得進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光染料減少，檢測到的熒光變?nèi)?，而線粒體跨膜電位的崩潰導(dǎo)致NADPH耗盡，隨后呼吸鏈上過氧化陰離子過度產(chǎn)生，引發(fā)呼吸鏈的解聚，最終伴隨三磷酸腺苷合成不足甚至合成停止，加速了細(xì)胞凋亡或壞死的進(jìn)程。線粒體作為細(xì)胞活性氧如氧反應(yīng)產(chǎn)物的主要來源之一，凋亡刺激使線粒體產(chǎn)生的氧反應(yīng)產(chǎn)物增多，也促進(jìn)了細(xì)胞凋亡〔6〕。

Bcl-2和Bax是Bcl-2基因家族中的重要成員，在細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制方面起重要作用〔7〕。Bcl-2蛋白主要表達(dá)于線粒體膜與核膜上，其在線粒體水平上即可對抗各種凋亡刺激，主要體現(xiàn)在增強(qiáng)線粒體膜電位，維持線粒體膜的完整性，從而抑制線粒體釋放促凋亡蛋白，已有研究顯示Bcl-2蛋白還具有直接抗氧化作用〔8〕。Bax在正常細(xì)胞中主要定位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞受到死亡信號刺激后，發(fā)生構(gòu)像變化，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞器膜上，尤其是線粒體外膜上，與抗凋亡蛋白Bcl-2形成異源二聚體〔9〕，拮抗Bcl-2，使Bcl-2喪失對凋亡的抑制作用，引起細(xì)胞器功能喪失和各種促凋亡因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，魚藤素作用于Ec-109細(xì)胞能夠上調(diào)Bax表達(dá)且下調(diào)Bcl-2表達(dá)，這說明魚藤素通過上述某些途徑激活了促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡的基因，同時(shí)也能夠下調(diào)抑制凋亡的基因，這種雙重作用的結(jié)果導(dǎo)致了凋亡的產(chǎn)生。

本文結(jié)果表明魚藤素可導(dǎo)致線粒體跨膜電位的開放，同時(shí)促進(jìn)凋亡蛋白的釋放及下調(diào)抗凋亡蛋白含量，從而誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡，為魚藤素的臨床應(yīng)用提供體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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